[發明專利]一種促進未成熟卵母細胞體外成熟的培養基及其應用

有效

• 申請號: 201710602050.0
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107460161B
• 公開（公告）日: 2020-07-21
• 發明（設計）人: 侯云鵬;胡洪梅;傅祥偉;莫顯紅
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明涉及一種促進未成熟卵母細胞體外成熟的培養基及其應用。本發明通過研究不同的添加物對未成熟卵母細胞的作用，篩選出一種能促進未成熟卵母細胞體外成熟的培養基，該培養基是在常規卵母體外成熟培養液中添加20?100μM的BAPTA?AM而制得，該培養基安全無毒副作用，能夠使未成熟卵母細胞特別是三級卵丘?卵母細胞復合體中的卵母細胞減數分裂，提高該類細胞的體外發育能力，促進細胞成熟，提高細胞成熟后的孤雌激活后卵裂率和囊胚發育率，進一步提高胚胎質量。本發明培養基的應用為動物胚胎的體外繁殖技術提供了有利支持，應用前景良好。

技術領域

本發明涉及一種促進未成熟卵母細胞體外成熟的培養基及其應用，屬于繁殖生物學技術領域。

背景技術

繁殖生物學上，胚胎生產需要大量卵源，一般會采取從屠宰后動物卵巢直接獲得的卵母細胞，或者采用活體采卵的方式，從活體動物的卵巢獲取卵母細胞，但是，由于從卵巢獲取的卵母細胞并未完全成熟，因此需要通過一段時間的體外成熟培養，將未成熟卵母細胞培養成熟后，才能完成后續的體外授精、發育為胚胎等階段，真正實現繁殖生產。

哺乳動物的卵巢含有大量未成熟卵母細胞，因此，從卵巢直接取未成熟的卵母細胞出來進行體外成熟培養是獲取大量成熟卵母細胞最有效、最經濟的途徑，可以實現大規模的優良品種遺傳物質商業化生產，也由此建立了很多卵母細胞體外培養的體系，卵母細胞形態與其成熟，受精，發育等能力之間的關系已經明確。但是體外成熟的卵母細胞與體內成熟的相比，仍然具有很大差距，因為從卵巢抽取而得的卵母細胞中大多數都沒有發育成熟，常規從卵巢中獲得的未成熟卵母細胞又稱為卵丘-卵母細胞復合體，即COCs，分為四級，一級卵COCs胞質均勻，周圍有5層及以上顆粒細胞；二級COCs胞質均勻，周圍有2～4層及以上顆粒細胞；三級COCs胞質不均勻、周圍有2層以下或部分裸露顆粒細胞；四級COCs并不成形。COCs可以通過目前的培養體系進行體外成熟培養，發育為可用的成熟卵母細胞，一級COCs約有80％左右能通過常規的體外成熟培養成為成熟可用的卵母細胞，二級COCs約有40％左右能通過常規的體外成熟培養成為成熟可用的卵母細胞，三級COCs是抽取到的卵母細胞中數量最多的一種，但是采用常規體外成熟培養體系只有30％左右能發育成熟，四級COCs不能發育成熟，只能棄置。但是，采集到COCs里，一級和二級COCs都只有少量，數量最多的為普遍認為不可用的胞質不均勻、周圍顆粒細胞有2層以下或部分裸露的三級COCs。

如果通過體外成熟培養，能把每次取卵獲得的數量最多的三級卵丘-卵母細胞復合體能發育成為成熟的卵母細胞，這就可以為育種、克隆、性別控制、細胞核移植、轉基因動物生產等提供豐富的成熟卵源，變廢為寶。對高價值的種畜來說能夠擴大其優秀基因的傳播，對人而言更是可以減輕取卵的痛苦，對很多卵巢功能衰退的大齡女性來說，也看到了利用自身卵子生育后代的希望。

BAPTA-AM(1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酰氧甲基酯)是選擇透過性膜Ca²⁺螯合劑，進入細胞后在脂酶作用下釋出BAPTA，快速與Ca²⁺絡合，控制細胞內鈣水平，是研究Ca²⁺對細胞功能調節作用的標準的科研工具藥，具有以下優點：對Ca²⁺選擇性強、親和力強，結合及解離速度快；穩定并受pH影響小；化學計量簡單，與Ca²⁺結合比是1:1；對細胞安全性高，容易進入細胞而對細胞沒有損傷，有效劑量范圍內沒有毒性。有研究證明Ca²⁺激活核酸內切酶是細胞凋亡過程中產生DNA碎片的原因，BAPTA-AM絡合Ca²⁺后，抑制了核酸內切酶的活性，保護細胞。但是尚不確定BAPTA-AM能否促進三級卵丘-卵母細胞復合體的體外成熟培養，并用于胚胎生產，目前也尚無此方面的研究報道。

發明內容

本發明目的是提供一種促進未成熟卵母細胞體外成熟的培養基。本發明的另一目的是利用該培養基體外促進卵丘-卵母細胞復合體成熟的方法。

本發明提供的促進未成熟卵母細胞體外成熟的培養基中含有BAPTA-AM。