[發明專利]仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法

在審

• 申請號: 201710594013.X
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN107245525A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 王振玲;郭艷杰;王黎霞;王金秋
• 申請（專利權）人: 北京農業職業學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/19
• 代理公司: 北京永創新實專利事務所11121
• 代理人: 姜榮麗

1.仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法，其特征在于：包括如下步驟，

第一步，樣本收集；

第二步，糞便樣本大腸桿菌的分離及鑒定；

第三步，血清型鑒定；

第四步，毒力因子結果檢測；

第五步，含有多種毒力因子大腸桿菌的全基因組測序分析；

第六步，全基因組序列分析。

2.根據權利要求1所述的仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法，其特征在于：所述的樣本收集從豬場收集了400份仔豬腹瀉糞便樣本，每個豬場都有基礎母豬500頭以上；仔豬飼養在水泥帶排孔的地面。

3.根據權利要求1所述的仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法，其特征在于：第二步具體包括，

(1)糞便樣本培養于含有5％血清的胰蛋白胨培養基中，37℃培養20h；

(2)從胰蛋白胨培養基中挑取細菌克隆進一步培養于麥康凱固體培養基，37℃培養20h；經過3代純化，挑取細菌克隆進一步培養于LB固體培養基，37℃培養12h；

(3)將步驟(2)經過LB固體培養基得到的分離菌純培養物分別作吲哚試驗、甲基紅試驗、VP試驗、構椽酸鹽利用試驗和三糖鐵培養基培養試驗，逐一鑒定篩選，以大腸桿菌參考菌株ATCC 25922作對照，篩選出的大腸桿菌菌株，再做葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、尿素發酵試驗。

4.根據權利要求1所述的仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法，其特征在于：第三步具體為，將大腸桿菌分離菌于121℃培養2h，提取菌體抗原；應用171種O抗血清進行玻片凝集試驗檢測O抗原，NaCl作為陰性對照，陽性結果應用試管凝集實驗進一步確認實驗結果。

5.根據權利要求1所述的仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法，其特征在于：第四步具體為，

應用PCR方法檢測分離菌株的毒力因子sta,stb,astA,eaeA,stx2e,F4,F18,sepA；PCR產物應用0.8％的瓊脂糖凝膠進行分離鑒定。

6.根據權利要求1所述的仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法，其特征在于：第五步具體為，

對含有sta、F18、eae A、stx2e、sepA毒力因子的大腸桿菌進行測序分析；基因組序列采用Hiseq2000測序系統進行全基因組測序；將大腸桿菌基因組DNA使用nanodrop2000和Aglent2100做質檢，檢測合格后進行文庫制備和文庫質檢；PE100下機數據進行質檢，得到合格數據clean data，將clean data分別做de novo拼接，使用Glimmer3.0程序對基因ORF序列進行預測，將ORF序列與NCBI nt數據庫和大腸桿菌全基因數據庫進行比對，對預測的基因進行校對；將ORF序列與KEGG和GO數據庫進行比對，對預測的基因進行功能注釋。

7.根據權利要求1所述的仔豬腹瀉大腸桿菌的全基因組測序分析方法，其特征在于：第六步具體為，

血清型確定通過O抗原加工系統基因wzx,wzy,wzm，wzt，確定O抗原，鞭毛蛋白基因fliC,flkA,flmA,flnA及fllA確定H抗原；關于O,H抗原基因的數據庫來源于NCBI核酸序列庫；應用JSpecies確定大腸桿菌平均核酸同源性分析；應用BLASP軟件分析毒力因子及耐藥基因；以大腸桿菌O157:H7,O145:H28及O104:H4全基因組序列作為參考；應用VFDB病原菌毒力因子數據庫作為毒力因子分析的參考數據庫；應用RGI軟件及CARD數據庫對耐藥基因進行注釋。