[發明專利]基于ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法

在審

• 申請號: 201710587759.8
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107227367A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 劉育辰;郝杰;劉剛;李悅;袁思文;金文淵
• 申請（專利權）人: 貴陽中醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙)11362
• 代理人: 郭防,石誠

技術領域

本發明涉及一種藥用甘草親緣關系鑒定方法，特別是一種基于ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法(基于ITS2序列的藥用甘草鑒定方法)。

背景技術

甘草屬Glycyrrhiza Linn.全球約20個物種。我國有8個種，分別為甘草(G.uralensis)、光果甘草(G.glabra)，又名洋甘草、脹果甘草(G.inflata)、無腺毛甘草(G.eglandulosa X.Y.Li.)、粗毛甘草(G.aspera Pall.)，以及刺果甘草(G.pallidiflora Maxim.)、云南甘草(G.yunnanensis Cheng f.et L.K.Dai ex P.C.Li)和圓果甘草(G.squamulosaFranch.)。2015版《中華人民共和國藥典》中明確指出我國藥用甘草為甘草、光果甘草及脹果甘草的干燥根及根莖，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的功效。但是，有些地區將其他一些品種作為甘草收購和使用，如在新疆石河子等地，因為無腺毛甘草根和根莖有甜味，在當地將其作為甘草收購和使用；此外，還有云南甘草、粗毛甘草在當地也有作藥用甘草使用的習慣。李學禹也指出民間將刺果甘草作為藥用。雖然他同時指出刺果甘草并非商品藥材，但甘草作為根莖類藥材，屬內各物種外形相似，不易區分，故混用現象也屢見不鮮，藥用情況混亂，嚴重影響了臨床用藥的有效性和安全性。

甘草的臨床需求量很大，有“十方九草”之稱，除此之外，甘草還作為添加劑用于生活和化工業的多個方面。廣泛的用途導致甘草需求量逐年增加，野生甘草資源急劇下降。為了保護甘草資源，國家在提倡人工種植和資源保護的同時，還制定了相關制度進行規范化的管理和控制。然而，申請人在進行甘草資源調查過程中還發現人工種植甘草中存在諸多變異、雜交現象，很難界定它的分類以及明確是否為藥用甘草，使甘草用藥的安全性和有效性受到了很大質疑。除人工種植外，目前從國外引進甘草也是解決國內甘草市場資源短缺的常用方法，但全球甘草屬下物種較多，國外甘草種屬是否可以作為我國藥用甘草也是我們需要亟待解決的一個問題。

甘草的傳統鑒定方法主要有形態學鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等。但這些方法的檢測結果受樣品植株生長環境、發育階段以及各種加工使用情況的影響較大。加之各甘草物種作為根莖類藥材，外形相似，不易區分，使得甘草市場存在藥用情況混亂的現象，嚴重影響了臨床用藥的有效性和安全性。藥用甘草如何鑒定是我們需要亟待解決的另一個問題。

因此，現有技術中，甘草屬內甘草物種不易區分，使得甘草市場存在藥用情況混亂的現象，嚴重影響了臨床用藥的有效性和安全性。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種基于ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法。本發明能對甘草屬內藥用甘草物種與其近緣種進行區分鑒定，使得藥用甘草物種與其近緣種容易被區分，避免了甘草藥用情況混亂，確保了甘草臨床用藥的有效性和安全性。

本發明的技術方案：基于ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法，包括對藥用甘草及其近緣種樣品親緣關系的鑒定。

前述的ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法中，所述的對藥用甘草及其近緣種樣品親緣關系的鑒定；包括DNA提取、PCR擴增、測序和確定甘草親緣關系。

前述的ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法中，所述的DNA提取；是取甘草樣本組織，用酒精擦拭表面后晾干，用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，提取過程中水浴時間為50-70min，將總DNA稀釋至8-12ng·μL^-1，-22℃--18℃下保存。

前述的ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法中，所述的PCR擴增；是以正向引物和反向引物進行擴增反應，得擴增產物；所述的測序；是將擴增產物純化后，對其進行雙向測序。

前述的ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法中，所述的正向引物；是ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT。

前述的ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法中，所述的反向引物；是GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT。

前述的ITS2序列的藥用甘草親緣關系鑒定方法中，所述的擴增反應；是擴增程序為：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles；72℃10min；擴增反應體系為：2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL，正、反向引物各1.0μL，總DNA3.0μL，加ddH₂O至25.0μL。