[發明專利]擬除蟲菊酯殘留的ELISA檢測試劑、試劑盒、應用及檢測方法

在審

• 申請號: 201710587465.5
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107505467A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 趙云生;殷玉潔;董美娟;毛福英;高曉娟;張新慧;付雪艷;王建寰;趙建軍
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及化學檢測領域，尤其涉及一種擬除蟲菊酯殘留的ELISA檢測試劑、試劑盒、應用及檢測方法。

背景技術

我國寧夏枸杞已大量生產并進行出口貿易，但枸杞病蟲害發生嚴重，主要病蟲害一年發生多代，蟲類同期、蟲態生活史重疊現象極為普遍，防治難度大，其中蟲害有38種，病害有5種，早在2002年寧夏就已在全國率先開展“無公害枸杞行動計劃”，選用高效低毒低殘留農藥，如擬除蟲菊酯類農藥、新開發的雜環類農藥(吡蟲啉)、生物源農藥(苦參堿)等用于枸杞蟲害防治。并對氰戊菊酯、氯氰菊酯及溴氰菊酯等具有間苯氧基苯甲酸(PBA)結構的菊酯類農藥進行研究。

目前國內外采用的農藥殘留檢測方法主要有色譜法、波譜法和儀器分析法(如GC、HPLC、GC/MS、LC/MS、GC/MS+MS、LC/MS+MS)。以上方法雖檢測準確，但成本高，耗時長，需要具備一定技術水平的專業人員才能進行操作，只適合在實驗室進行，限制了該方法在大規模的農藥殘留監測和現場實時檢測中的應用。

發明內容

有鑒于此，本發明實施例提供了一種擬除蟲菊酯殘留的ELISA檢測試劑、試劑盒、應用及檢測方法，主要目的是解決使用不方便、成本高及檢測慢的問題。

為達到上述目的，本發明主要提供了如下技術方案：

一方面，本發明實施例提供了一種擬除蟲菊酯殘留的ELISA檢測試劑，所述檢測試劑包括擬除蟲菊酯的單克隆抗體。

作為優選，所述擬除蟲菊酯殘留為枸杞中擬除蟲菊酯類農藥殘留。

作為優選，所述單克隆抗體的制備方法包括以下步驟：

用碳二亞胺法將間苯氧基苯甲酸和牛血清蛋白偶聯合成免疫抗原；

用羰基二咪唑法將間苯氧基苯甲酸和雞卵清蛋白偶聯合成檢測抗原；

用所述免疫抗原免疫小鼠，將其脾細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞；

用ELISA法篩選出陽性雜交瘤細胞；

用有限稀釋法對所述雜交瘤細胞進行克隆并分離陽性雜交瘤細胞株，獲得穩定分泌抗擬除蟲菊酯的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

采用腹水誘導法，將含有所述雜交瘤細胞株的培養液注入小鼠腹腔產生腹水，所述腹水含有所述擬除蟲菊酯的單克隆抗體。

另一方面，本發明實施例提供了一種擬除蟲菊酯殘留的ELISA檢測試劑盒，包括：

96孔酶標板；

檢測抗原PBA-OVA；

擬除蟲菊酯單克隆抗體；

HRP標記的羊抗鼠酶標二抗；

間苯氧基苯甲酸標準品溶液；

碳酸鹽緩沖液，0.1M，pH＝9.6；

洗滌液PBST，0.01M，pH＝7.4

底物TMB顯色液，0.15mg/ml；

反應終止液，2mol/L H₂SO₄。

又一方面，本發明實施例提供了上述檢測試劑在制備擬除蟲菊酯殘留的ELISA檢測試劑盒中的應用。

再一方面，本發明實施例提供了一種擬除蟲菊酯殘留的ELISA檢測方法，所述方法包括以下步驟：

用碳酸鹽緩沖液將檢測抗原稀釋至1μg/ml，加入96孔酶標板，每孔加入100μL，4℃包被過夜；

向每孔中加入250μL洗滌緩沖液洗滌3-5次，棄洗滌液，拍干；

向96孔酶標板中加入枸杞樣本50μl，擬除蟲菊酯單克隆抗體50μl，加入空白對照，25℃反應30min；

向每孔中加入洗滌液洗滌3-5次，棄洗滌液，拍干；

向96孔酶標板每孔中加入用封閉液稀釋1000倍的，HRP標記的羊抗鼠酶標二抗，每孔100μL，25℃避光反應30min；

向每孔中加入洗滌液并洗滌3-5次，棄洗滌液，拍干；

向96孔酶標板中加入酶底物TMB顯色劑，每孔加入100μL，室溫避光反應15min；

向96孔酶標板中加入終止液，每孔100μL，終止反應，用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光光度OD值；

結果判斷：用磷酸鹽緩沖液將間苯氧基苯甲酸標準品分別稀釋成濃度為0，125，250，500,1000及2000ppb的五個不同濃度后檢測OD值；