[發明專利]一種環狀探針和基于環狀探針捕獲的測序文庫構建方法

在審

• 申請號: 201710576708.5
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN109252224A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 蕭卓;劉華勇;袁劍穎;石先燈;李英鎮
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

一種環狀探針和基于環狀探針捕獲的測序文庫構建方法，該方法包括：將環狀探針與靶標核酸退火雜交，其中環狀探針為線性核酸探針，其包括兩個末端的特異性臂區和中間的通用序列，其中特異性臂區用于與靶標核酸雜交，雜交后探針的兩個末端首尾相向，通用序列用于連接兩個末端的特異性臂區并作為通用引物的識別區域；在聚合酶和連接酶的作用下，使環狀探針的3’末端以靶標核酸為模板進行擴增并與5’末端連接形成環狀分子；加入核酸外切酶將線性核酸分子消化。本發明利用擴增原理，解決捕獲效率低和成本高昂的問題，利用環狀探針解決引物對數量有限的問題，利用通用引物擴增解決多重擴增均一性差的問題。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種環狀探針和基于環狀探針捕獲的測序文庫構建方法。

背景技術

隨著測序技術發展，第二代測序(NGS)迅猛發展，依靠著高通量的特點，成為了研究DNA和RNA的主要工具。在NGS中，人們可以同時對高達1億條核酸序列進行同步的測序，在堿基上的通量到達了Gb的數量級，對整個基因組進行測序(WGS)也變得越來越常規。盡管在技術上可以做到WGS，但是測序時間和測序花銷卻是限制其應用的因素。通過對特定感興趣區域進行捕獲，既可以避免不需的序列信息占據結果中的大部分，降低所需數據量最終節省成本，也可以提高特定區域的測序深度，從而提供更有價值的信息。

對特定感興趣區域進行捕獲，現有主流技術方案有兩種：NimbleGenSeqCap技術方案和Ampliseq技術方案。NimbleGenSeqCap技術方案，捕獲對象為已經添加接頭的文庫，通過對目標區域設計長度為50-105bp的帶標記線性探針，經雜交對目標區域片段進行富集，然后進行高通量測序。整個流程包括常規流程的文庫構建、標記探針雜交、磁珠分離、目標文庫洗脫、目標文庫的二次擴增。Ampliseq技術方案，在建庫之間對目標區域進行擴增，以增加對測序結果中目標區域的檢出。技術針對每一個目標區域設計一對或多對引物，這些引物的擴增產物末端之間有重疊，使得每個區域對應的PCR產物可以覆蓋整個區域。PCR之后，對PCR進行常規的NGS建庫以及測序。由于經過了指數擴增，目標區域的核酸在總核酸中占的比例大大提升，因此能用于低頻率突變的檢測等應用。

NimbleGenSeqCap技術方案的缺點有以下幾點：(1)捕獲效率低，全外芯片平均捕獲效率在50％-60％，小芯片捕獲效率平均在40％；(2)芯片成本高昂，單個反應價格最低為1200元以上，加上洗脫試劑，單次試驗成本大于1500元；(3)試驗操作復雜繁瑣，穩定性差，不利于產業化推廣；(4)不適用較小區域的捕獲，區域越小捕獲效果越差。Ampliseq技術方案的缺點有以下幾點：(1)多重PCR技術存在穩定性缺陷，不同引物擴增效率差異較大，不能有效反映不同靶標之間量的差異；(2)不適用于已經片段化樣本，對片段化樣本靈敏性大大降低；(3)復雜區域引物效率低下，很難捕獲到；(4)PCR擴增循環數高，引入的PCR錯誤會影響低頻檢測。

發明內容

本發明提供一種環狀探針和基于環狀探針捕獲的測序文庫構建方法，具有高效、低成本、均一性好、簡便快捷的優勢。

根據第一方面，一種實施例中提供一種基于環狀探針捕獲的測序文庫構建方法，包括：

將環狀探針與靶標核酸退火雜交，其中上述環狀探針為線性核酸探針，其包括兩個末端的特異性臂區和中間的通用序列，其中上述特異性臂區用于與上述靶標核酸雜交，雜交后探針的兩個末端首尾相向，上述通用序列用于連接兩個末端的特異性臂區并作為通用引物的識別區域；

在聚合酶和連接酶的作用下，使上述環狀探針的3’末端以上述靶標核酸為模板進行擴增并與5’末端連接形成環狀分子；和

加入核酸外切酶將線性核酸分子消化。

進一步地，上述通用引物是帶有測序接頭的引物；上述核酸外切酶將線性核酸分子消化之后，加入上述通用引物進行PCR擴增。