[發(fā)明專利]SPNP?I在制備Nav1.4通道工具試劑中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710572687.X
• 申請(qǐng)日: 2017-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN107163127A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長(zhǎng)沙沁才生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種活性多肽在制備離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-I（簡(jiǎn)寫為SPNP-I）在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Nav1.4型鈉通道抑制劑中的用途。

背景技術(shù)

電壓門控鈉通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鈉通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關(guān)鍵性作用，電壓門控鈉通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。電壓門控鈉通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動(dòng)物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過與鈉通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鈉通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測(cè)鈉通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門控活動(dòng)機(jī)制外，還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-I在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Nav1.4型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-I（簡(jiǎn)寫為SPNP-I），其氨基酸序列為：

NH₂-Ala Cys Gly Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro-OH,

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-I作為單一有效活性組份用于制備Nav1.4型鈉通道抑制劑。

所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-I在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Nav1.4型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鈉肽-I的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鈉肽-I作為單一有效活性組分用于制備Nav1.4型鈉通道抑制劑，以細(xì)胞外給藥的方式制備成Nav1.4型鈉通道工具試劑。

蜘蛛抑鈉肽-I在制備Nav1.4型鈉通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為1 μmol/L。

蜘蛛抑鈉肽-I對(duì)Nav1.4型鈉通道的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依從性，是一種較好的Nav1.4型鈉通道工具試劑。

附圖說明

圖1是SPNP-I對(duì)Nav1.4型鈉通道的影響。

圖2是SPNP-I抑制Nav1.4型鈉通道的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過細(xì)胞外給藥途徑，采用轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞模型來說明蜘蛛抑鈉肽-I的Nav1.4型鈉通道抑制作用。

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1人胚腎細(xì)胞（HEK293T）的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞適應(yīng)酸性環(huán)境,pH 值在 6.9～7.1 時(shí),可順利貼壁生長(zhǎng),換液時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基。

1.1.1細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

(1) HEK293 細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)為達(dá)80-90%匯合，待細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿后，吸掉培養(yǎng)液。

(2) 加適量PBS漂洗兩次，吸掉。

(3) 加0.5mL 0.25%胰酶，搖勻。37℃培養(yǎng)箱中胰酶處理2-3min。于顯微鏡下觀察細(xì)胞是否全部脫壁。加入適量10% 新生牛血清DMEM培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng)。

(4) 用移液管將細(xì)胞團(tuán)輕輕吸打成單個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞按1∶3平均分入裝有預(yù)熱培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO₂、15%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2陽離子性的脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染方法: