[發明專利]體外重折疊波形蛋白的方法及其應用

有效

• 申請號: 201710565618.6
• 申請日: 2017-07-12
• 公開（公告）號: CN107344963B
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 張雁;楊春雨;勞滔滔;林潮喜
• 申請（專利權）人: 深圳市倍諾博生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/00;G01N21/19;G01N33/68;G01N33/53
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本申請提供了體外重折疊野生型或突變型波形蛋白的方法、通過該方法制備的野生型或突變型波形蛋白的應用，以及鑒定正確重折疊的波形蛋白的方法。

技術領域

本申請大體涉及蛋白質工程領域，更具體而言，本申請涉及波形蛋白的制備方法，特別是體外重折疊波形蛋白的方法及其應用。

背景技術

在類風濕性關節炎病人中已發現，波形蛋白含兩個甘氨酸到精氨酸的突變，并且蛋白表面的精氨酸脫氨瓜氨酸化。用體外重組表達的瓜氨酸化突變型波形蛋白(mutantcitrullinated vimentin，MCV)作為抗原來檢測血清中抗體含量，是一種新的類風濕性關節炎檢測方法，其靈敏度和特異性都比現有的類風濕性關節炎因子和環瓜氨酸肽臨床檢測方法高。

波形蛋白是細胞骨架中間絲家族成員之一。波形蛋白的完整三維結構迄今未知，雖然在PDB(Protein Data Bank)有多個已報道的波形蛋白片段結構(4YPC、4YV3、3G1E、3S4R、3SSU、3SWK、3TRT、3UF1、3KLT)，但是最大片段也僅覆蓋100多個氨基酸。異源表達的人波形蛋白及突變型波形蛋白可溶性差，需要體外變性后進行重折疊。然而，人波形蛋白及突變型波形蛋白的重折疊的體外條件目前報道的方法不明確。例如，已有報道使用層析法，用多組氨酸標記突變型波形蛋白，將其在變性條件下親和層析結合在鎳柱上，再用不含變性劑的含咪唑的緩沖液洗脫。但是，此方法的重復性較差，變性后的突變型波形蛋白無法洗脫，或洗脫后呈沉淀狀態，明顯未能正確折疊。此外，波形蛋白折疊后的蛋白構型尚無定性標準，折疊后易形成不同分子量大小的中間絲，無法準確定量用于后續的抗體含量檢測。

因而，迫切需要建立正確折疊波形蛋白和/或質量控制的方法，以滿足簡便且低耗地診斷類風濕性關節炎的需求。

發明內容

第一方面，本申請提供體外重折疊野生型或突變型波形蛋白的方法，包括以下步驟：使重組表達獲得的野生型或突變型波形蛋白制備物與pH為6-10的包含變性劑和還原劑的緩沖液接觸以溶解所述制備物，并獲得蛋白溶液；以及在氧化還原混合物存在下，通過透析法階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度，以重折疊野生型或突變型波形蛋白。

在一些實施方案中，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度包括通過透析法將所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中變性劑的濃度階段性地降低至初始濃度的50％、25％和0％。在一些實施方案中，通過使用包含所述變性劑并且所述變性劑的濃度梯度降低的三種透析液，所述三種透析液中變性劑的濃度分別為所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中變性劑的濃度的50％、25％和0％。

在一些實施方案中，野生型或突變型波形蛋白制備物通過以下步驟獲得：使宿主細胞表達野生型或突變型波形蛋白；裂解宿主細胞，獲得包涵體形式的野生型或突變型波形蛋白制備物。

在一些實施方案中，變性劑為尿素和/或鹽酸胍。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為1～10M。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為4～8M。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為8M。在該具體實施方案中，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度可以使用三種透析液依次實施透析，所述三種透析液中尿素和/或鹽酸胍的濃度分別為4M、2M和0M。

在一些實施方案中，還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)或β巰基乙醇。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為1～20mM。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為5～15mM。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為10mM。

在一些實施方案中，氧化還原混合物為還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些實施方案中，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比例為1:10。