[發(fā)明專利]河南華溪蟹生殖標(biāo)記基因vasa及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710557736.2
• 申請(qǐng)日: 2017-07-10
• 公開（公告）號(hào): CN107267536A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫敏;王蘭;杜曉琳;李怡婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/55
• 分類號(hào): C12N15/55;C12N9/14;C12N15/10;C07K14/435
• 代理公司: 山西五維專利事務(wù)所(有限公司)14105
• 代理人: 張福增

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)一種生殖標(biāo)記基因，具體為生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因vasa的全長(zhǎng)cDNA克隆及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

甲殼動(dòng)物十足目(decapoda)短尾次目(brachyura)中的一個(gè)特殊分支—淡水蟹(freshwater crabs)，終身生活在淡水環(huán)境中。溪蟹是野生水資源中廣泛分布的淡水蟹類，其生殖發(fā)育方式與其它十足動(dòng)物存在顯著差異。溪蟹卵粒特別大，產(chǎn)卵量小，卵殼厚，胚胎直接發(fā)育，卵內(nèi)變態(tài)。而大多數(shù)海蟹和洄游性絨螯蟹卵粒非常小，產(chǎn)卵量很大，卵殼薄，胚胎間接發(fā)育。

然而，迄今為止，溪蟹的生殖發(fā)育調(diào)控方式尚不清楚，其人工繁殖一直無(wú)法掌控。主要原因是溪蟹的生殖規(guī)律仍屬未知，如溪蟹卵子發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)規(guī)律如何？生殖細(xì)胞是否發(fā)育良好，其質(zhì)量如何？哪些重要分子在卵子發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用？因此，在溪蟹中鑒定并開發(fā)生殖標(biāo)記分子，成為解決相關(guān)問(wèn)題的有效快捷手段。

基因vasa所編碼的蛋白為ATP-依賴的RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白。VASA蛋白具有非常保守的結(jié)構(gòu)域：N端RGG(Arg-Gly-Gly)重復(fù)序列和解旋酶核心結(jié)構(gòu)，包含DEAD-box的8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為DEXDc和HELICc結(jié)構(gòu)域。解旋酶的核心結(jié)構(gòu)不僅在RNA解旋中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且解旋酶活性本身為VASA蛋白在生殖質(zhì)中定位所必須。

基因vasa最早是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)。在模式生物中，vasa已被作為生殖標(biāo)記分子廣泛用于生殖細(xì)胞的遷移、分化和發(fā)生等研究。VASA蛋白的生物學(xué)功能也已在模式生物中得到證實(shí)。蛋白功能的研究表明，VASA蛋白作為參與生殖細(xì)胞中如轉(zhuǎn)錄、pre-mRNA剪切、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯起始、核糖體生物發(fā)生等幾乎所有RNA的代謝過(guò)程。研究表明，突變果蠅vasa基因?qū)е律臣?xì)胞分化異常、卵子發(fā)生缺陷，并引起雌性個(gè)體不育。突變小鼠vasa基因，導(dǎo)致卵巢不育，造成精子發(fā)生過(guò)程被阻斷、精子缺失。

甲殼動(dòng)物中，如中華絨螯蟹(Eriocheir Sinensis)、擬穴青蟹(Scylla Paramamosain)、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)和中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)等不同物種中分別克隆了生殖基因vasa。盡管，vasa mRNA在這些物種中都特異存在于生殖細(xì)胞中，但是vasa基因和蛋白的序列與結(jié)構(gòu)因物種不同而存在著明顯差異。中華絨螯蟹中克隆了2369bp的vasa基因全長(zhǎng)cDNA，包含DEAD-box蛋白家族的8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(CCHC)和一個(gè)Q-結(jié)構(gòu)域。利用RACE-PCR方法，在擬穴青蟹中克隆了2,851bp的vasa基因全長(zhǎng)cDNA。

目前，有關(guān)溪蟹的基因組數(shù)據(jù)非常缺乏，生殖分子的信息幾乎未知，因此，對(duì)了解溪蟹的特殊生殖方式，指導(dǎo)溪蟹的生產(chǎn)繁殖及保護(hù)溪蟹的種質(zhì)資源等理論、實(shí)踐中帶來(lái)諸多不便，亟待尋找并開發(fā)一種生殖標(biāo)記，為溪蟹人工繁殖中確定生殖細(xì)胞的狀態(tài)和發(fā)育質(zhì)量提供便捷有效的檢測(cè)手段。

河南華溪蟹，屬于甲殼綱，十足目，短尾次目，華溪蟹科，不僅是重要的資源動(dòng)物，而且在水生態(tài)環(huán)境保護(hù)中，已被用作水環(huán)境污染監(jiān)測(cè)的指示生物。雖然，課題組在河南華溪蟹中對(duì)部分vasa基因進(jìn)行了分離，但是，所獲得的序列僅為vasa的部分序列。涉及編碼重要功能域的序列，以及決定vasa在不同細(xì)胞中的表達(dá)和定位的3’UTR序列仍未獲得(李怡婷，河南華溪蟹生殖調(diào)控基因vasa的克隆和原核表達(dá)，2016，碩士論文，王蘭，孫敏)。因此，到目前為止，在具有特殊生殖發(fā)育方式的溪蟹中，有關(guān)基因vasa的分離仍待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是為探索溪蟹的特殊生殖和發(fā)育機(jī)制提供一種生殖細(xì)胞特異表達(dá)的標(biāo)記分子-基因vasa及其在表達(dá)鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明為溪蟹生殖細(xì)胞的鑒定和分期提供快捷準(zhǔn)確的方法。

本發(fā)明的另一目的是獲得河南華溪蟹基因vasa的全長(zhǎng)cDAN序列和完整的蛋白序列，進(jìn)而鑒定其物種特有的結(jié)構(gòu)特征，分析決定其在河南華溪蟹中表達(dá)定位的序列特征。

本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：