[發明專利]用于鑒定烤煙龍江911的引物組合及試劑盒、應用及鑒定方法

有效

• 申請號: 201710556620.7
• 申請日: 2017-07-10
• 公開（公告）號: CN107345251B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 張劍鋒;謝小東;楊軍;王姍姍;蔡聯合;武明珠;王中;李鋒;李澤鋒
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發明公開了一種用于鑒定烤煙龍江911的引物組合及試劑盒、應用及鑒定方法，屬于生物分子鑒別技術領域。本發明利用煙草420K高密度SNP芯片對近年來我國煙草主栽品種進行全基因組SNP分型，根據品種間多態性SNP位點篩選獲得了一套適用于鑒定烤煙龍江911的特異性SNP標記共16個，其物理位置基于栽培煙草品種紅花大金元的全基因組序列比對確定，包含SNP位點的基因序列，如SEQ ID NO:1～16所示。針對烤煙龍江911的SNP位點側翼序列，根據檢測方法的不同設計相應引物，可用于龍江911的品種鑒定。本發明基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術建立的龍江911鑒定方法，檢測周期短、通量高。

技術領域

本發明涉及一種用于鑒定烤煙龍江911的引物組合，同時還涉及包含該引物組合的試劑盒、應用及鑒定方法，屬于生物分子鑒別技術領域。

背景技術

煙草是一種重要的經濟作物，是卷煙生產的主要原料。烤煙品種龍江911是由黑龍江省煙草科學研究所以龍江851(windel)為母本、CV91為父本雜交，系譜法選育而成，于2000年12月通過全國煙草品種審定委員會審定。龍江911株式塔形，自然株高193.3cm，節距5.98cm，莖圍8.62cm，有效葉數15.8片。腰葉長78.2cm，寬34.0cm，頂葉長54.7cm，寬22.8cm，長橢圓形，葉尖急尖，葉色綠色，葉面皺，葉緣波浪狀，葉耳中等，葉肉組織細致，莖葉角度中；田間生長整齊，生長勢強；花序集中，花冠淡紅色；移栽至現蕾44天，移栽至中心花開放49天，大田生育期120天左右，全生育期178天。龍江911是近年來我國煙葉生產中重要的主栽烤煙品種，也是卷煙生產中重要的工業常用品種。

品種是優質煙葉原料生產的基礎，是影響煙葉品質最主要的因素之一。根據《中華人民共和國種子法》和《煙草專賣法》，為保證煙葉生產的穩定性和可持續發展，必須選用經全國煙草品種審定委員會審(認)定的品種，嚴禁種植劣雜品種。此外，煙草工業生產和產品開發對特定煙葉品種也提出了嚴格的要求。目前，我國面臨著煙草主栽品種遺傳背景狹窄，形態學上相似程度高難以區分鑒別的問題。煙草品種的檢測方法主要是田間種植鑒定法。但是，該方法存在田間種植規模大、鑒別項目多(鑒別性狀涉及株高、葉數、節距、葉長、葉寬、莖葉角度等)、周期長(跨越煙草不同生育期)、鑒別難度大(性狀指標差異小)、同一性狀年度間存在差異(受環境影響)等不足。煙草品種保護，種子純度的監測，煙葉真假檢測等方面，都迫切需要從分子水平上進行煙草DNA身份鑒定。

專利CN105734141A公開了一種鑒定煙草品種純度的分子生物學方法，包括：分別提取對照與待測煙草品種的基因組總DNA，采用最新測序技術對其進行適當深度的全基因組測序，基于煙草基因組參考序列利用生物信息學手段對它們進行序列拼接、組裝與全基因組序列比較，統計二者堿基差異，計算出待測煙草品種相對于對照煙草品種的純度百分比。該方法不受環境條件和季節影響，鑒定結果準確可靠，可從最小遺傳單位單堿基變異水平上準確鑒別煙草品種的純度，用于煙草品種親本提純與真偽鑒定。但是該方法操作復雜，檢測成本非常高。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性。與傳統的分子標記相比，SNP標記具有密度高、分布范圍廣、分型簡單等優點。隨著全基因組序列鑒定技術以及自動化的SNP芯片分型技術的發展，利用大規模、高通量SNP芯片進行遺傳多樣性研究已經變得越來越普遍。國家煙草基因研究中心設計研制出首張煙草高密度SNP芯片(420K Tobacco SNP array)，涵蓋絕大多數標簽SNP位點并均勻分布整個煙草基因組，為從全基因組水平上對煙草品種進行遺傳多樣性研究提供了便利。采用煙草高密度SNP芯片標記技術對煙草主栽品種的遺傳多樣性進行分析，可以篩選獲得特定主栽品種的特異性SNP分子標記，并依據該特異性SNP標記設計煙草品種鑒定方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于鑒定烤煙龍江911的引物組合。

其次，本發明還提供一種烤煙龍江911鑒定試劑盒。