[發明專利]一種檢測β珠蛋白基因點突變的靶序列互補淬滅探針及其試劑盒

有效

• 申請號: 201710551865.0
• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107385028B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 周萬軍;徐湘民;熊符;張強;溫曉君
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;舒勝英

本發明公開了一種檢測β珠蛋白基因點突變的靶序列互補淬滅探針及其試劑盒，該試劑盒由非對稱PCR單鏈DNA模板富集PCR擴增引物、靶序列互補淬滅探針、LA DNA聚合酶等組成。通過非對稱特異性PCR單鏈DNA模板富集人類β珠蛋白基因突變位點目的序列、特異性熒光探針的分子雜交及解鏈分析，檢測受檢樣本的β?地貧點突變基因型。該試劑盒對檢測β?地中海貧血突變位點的野生型和突變型具有良好的敏感性和準確性，重復性和穩定性很好，完全適用于β?地中海貧血點突變的臨床檢測。

技術領域

本發明屬于分子檢測領域，具體涉及一種檢測β珠蛋白基因點突變的靶序列互補淬滅探針及其試劑盒。

背景技術

人類β-珠蛋白基因簇位于11號染色體上，表達β珠蛋白鏈，與α珠蛋白鏈結合，形成具有功能血紅蛋白四聚體。正常情況下，人類珠蛋白基因所表達的α類和β類珠蛋白鏈比例適當(1:1)，當β珠蛋白基因缺陷，導致β鏈合成減少而α鏈相對過剩，即可導致β-地中海貧血疾病。地中海貧血(簡稱“地貧”)是全球最常見、對人類健康影響最大的單基因遺傳病之一，主要集中在地中海沿岸國家、東南亞、少數非洲地區和我國南方，保守估計全世界攜帶者近2億人。臨床上分為α-地貧和β-地貧。此病無有效治療手段，應用相應分析技術通過人群分子篩查，對夫婦雙方均為同類型地貧攜帶者的孕期胎兒進行產前診斷，以阻止重癥患兒出生是國內外公認的首選預防措施。導致β珠蛋白鏈合成減少而引起β-地中海貧血的根本原因是β珠蛋白基因突變，又稱β-地貧基因突變，包含點突變和大片段缺失兩種類型。

β-地貧主要由β珠蛋白基因點突變所引起(98％以上)。到目前為止，全世界已發現了200多種β-地貧基因突變，在中國已報道有60多種，其中中國南方報道有50余種。β-地貧基因不但遺傳異質性大，還存在明顯的地域性。在中國人群中，CD41-42(-CTTT)、CD17(AT)、–28(AG)、CD26(GA)、IVS-Ⅱ-654(CT)和CD71-72(+A)這6種突變占了全部突變類型的90％以上；另外–32(CA)、–31(AC)、–30(TC)、-29(AG)、Cap+1(AC)、Int(ATGAGG)、CD14/15(+G)、CD71/72(+T)、CD43(GT)、CD27/28(+C)、IVS-1-1(GT)、IVS-1-5(GC)、CD31(–C)在中國人群中也有一定的基因頻率。

眾所周知，通過DNA分析而獲得β-地貧基因型，不但是對個體β-地貧進行準確診斷的依據，也是提供遺傳咨詢、實施防控措施的基礎。當前β-地貧基因點突變的分子診斷和產前診斷策略，是采用相應的技術方法，分析β珠蛋白基因是否存在點突變。檢測技術的發展歷程中，擴增阻礙突變系統PCR(ARMS-PCR)，是分別針對每一個突變位點，采用兩個PCR反應管逐一檢測，操作繁瑣、費時費力，并且這種技術的檢測條件難以控制，易于出現假陰性和假陽性結果。隨后采用的等位基因特異性寡核苷酸雜交法(ASO)，大大減少了假陰性和假陽性結果，但仍需逐一檢測每一個突變位點，檢測通量低，費時費力。當前在臨床上常規使用的反向點雜交法(RDB)，可同時檢測中國人群中常見和次常見的17種突變類型，在一定程度上減小了勞動強度，增加了檢測通量，可是，此技術的操作流程依然繁瑣，先PCR擴增β珠蛋白基因2－3個目的DNA片段，然后再通過變性、雜交、洗膜、顯色等一系列操作再觀察檢測結果，同時，PCR產物的開蓋操作也大大增加了實驗室攜帶污染的風險。DNA測序分析也是當前可選的一種β珠蛋白基因點突變檢測方案，此技術操作過程是先PCR擴增，再PCR產物純化、測序PCR反應、測序儀上毛細管電泳分析等，同樣存在操作繁瑣、攜帶污染等問題。這些方法，檢測成本高、工作量大、操作繁瑣、檢測通量小，難以實現自動化和標準化，且存在PCR產物攜帶污染等技術局限，不能滿足當前α-地貧的大規模人群篩查和臨床常規分子診斷需要。