[發明專利]無物種限制的真核生物同時進行基因敲除和基因過表達

在審

• 申請號: 201710539383.3
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107164407A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 張琳琳;李廣磊;尚小云
• 申請（專利權）人: 王小平
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/62
• 代理公司: 北京迎碩知識產權代理事務所(普通合伙)11512
• 代理人: 張群峰,錢揚保

1.一種多基因同時過表達和/或敲除方法，包括：

將至少一個CAR構建于同一載體，并用同一個啟動子驅動表達，并且不同CAR之間利用2A短肽分開；和/或

將至少一個sgRNA構建于同一載體，不同sgRNA分別用啟動子U6驅動表達，并且不同的U6-sgRNA串聯在一起；

將所述載體電轉染導入同一細胞或個體，其中所述至少一個CAR在同一細胞或個體同時實現基因過表達，所述至少一個sgRNA在同一細胞或個體同時實現基因敲除。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述至少一個sgRNA在同一細胞或個體同時實現敲除胞內表達靶基因和胞膜表達靶基因，或同時實現敲除一條信號通路的上下游靶基因或幾條平行信號通路的不同靶基因。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述至少一個CAR為單個過表達的Tn-MUC1 CAR或Her2 CAR，所述至少一個sgRNA為單個靶向胞內表達靶基因hGATA3的sgRNA，并且CAR載體和sgRNA載體(的DNA片段)被串聯構建為一體。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述至少一個CAR為過表達的Tn-MUC1 CAR和/或Her2CAR，所述至少一個sgRNA為兩個分別靶向胞內表達靶基因hGATA3和胞膜表達靶基因hPD1的sgRNA，并且CAR載體和sgRNA載體被串聯構建為一體。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其中所述細胞為HEK293T細胞或人原代T細胞。

6.根據權利要求3或4所述的方法，其中Tn-MUC1CAR或Her2CAR是利用PiggyBac-transposon載體依次串聯人啟動子、CSF2RA嵌合受體信號肽、胞膜外抗原結合區、鉸鏈區、胞內信號傳導區和T2A短肽連接的抗性基因puromycin制備而成的。

7.根據權利要求6所述的方法，其中胞膜外抗原結合區為用于結合Tn-MUC1或Her2蛋白的CD19單鏈抗體(scFv)，依次串聯c-myc表位標記、CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區。

8.根據權利要求7所述的方法，其中胞內信號傳導區為CD28-4-1BB-CD3ζ，CD28和4-1BB為嵌合受體共刺激因子。

9.一種多基因同時過表達和/或敲除裝置，包括：

PBMC細胞準備系統；

Amaxa電轉試劑盒；

電轉染系統，接收來自Amaxa電轉試劑盒的電轉試劑并將其和用于過表達基因的質粒和用于基因敲除的質粒混合，形成電轉混合物體系；并接收來自PBMC細胞準備系統的PBMC細胞且在其中加入所述混合物進行電轉染；

CD3陽性T細胞富集系統，包含用于偶聯CD3/CD28抗體的磁珠；以及

篩培系統，用于篩選并培養擴增轉染后的T細胞。