[發明專利]一種快速檢測石蒜科植物中加蘭他敏含量的方法

在審

• 申請號: 201710539211.6
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107462656A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 李青竹;蔡友銘;張永春;楊柳燕;李心
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司31114
• 代理人: 張曉敏,費開逵

技術領域

本發明屬于生物堿類物質檢測領域，具體涉及一種快速檢測石蒜中加蘭他敏含量的方法。

背景技術

石蒜(Lycoris spp.)和朱頂紅(Hippestrum spp.)是石蒜科(Amaryllidaceae)球根草本植物，很多種是中國特有的觀賞和藥用花卉，富含多種石蒜科植物特有的生物堿成分。

迄今為止，從石蒜科植物中分離出超過500種結構各異的生物堿類化合物，植物化學研究表明，這類化合物具有多種藥理學功能，藥用價值極高。其中，加蘭他敏是一種異喹啉生物堿，作為乙酰膽堿酯酶抑制劑，可影響大腦尼古丁受體以及抑制乙酰膽堿酯酶活性，是治療阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，老年癡呆癥早期癥狀)的首選藥物之一，該藥已在歐美和中國主要市場批準上市(袁菊紅，2007；孫長生等，2011)。

盡管早在1962年Barton等研究者就首次人工合成了加蘭他敏，但由于其中手性碳的存在，合成條件嚴苛、步驟復雜、產率低、消旋產物不易拆分等因素的存在，化學合成的制備成本甚至高于從植物中直接提取。至今，野生的石蒜資源仍然是藥用加蘭他敏最重要的來源，因此，對石蒜中加蘭他敏的含量進行準確定性和定量分析是育種和生物堿類物質合成代謝研究的重要內容之一。

目前，對石蒜中加蘭他敏含量進行分析的方法主要有薄層色譜分離技術(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜檢測技術(high-performance liquid chromatography)、氣相色譜-質譜聯用分析技術(Gas Chromatography-Mass Spectrometry)和高效液相色譜-電噴霧離子化-質譜聯用分析技術(HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry,HPLC-ESI-MS)。

李明凱(石蒜生物堿分析方法的建立及其生物合成的研究，安徽農業大學，2012：1-69)利用薄層色譜分離技術，實現了加蘭他敏等生物堿類物質的初步分離，并且發現雙向薄層色譜比單向色譜更適合多種不同生物堿類物質的分離，該方法主要通過與已知的生物堿標樣(加蘭他敏、力可拉敏、石蒜堿)的遷移率進行對比，實現對樣品中生物堿種類的初步定性，但不能用于準確的結構和定量分析。

Quan等(Quan et al.,Photosynthetic characteristics of Lycoris aurea and monthly dynamics of alkaloid contents in its bulbs，African Journal of Biotechnology，11(15)：3686-3691，2012)利用高效液相色譜檢測技術，通過樣品與已知的生物堿標準品在同樣條件下的保留時間和峰面積的對比，進行了石蒜屬忽地笑中石蒜堿和加蘭他敏的定量研究，其單次提取石蒜鱗莖材料需要鮮樣20g(含水量90％左右)，折合石蒜鱗莖干樣2g，需要消耗甲醇110ml，鹽酸10ml，氯仿15ml，對植物樣本和試劑消耗極大，同時，其僅采用HPLC的方法，根據物質的保留時間進行含量檢測，無法對待測物質進行準確定性，因此物質定量結果不可靠，不能進行結構、定性和精確定量分析。

現有的GC-MS，HPLC-ESI-MS等技術，可以實現目標代謝產物的定性和定量分析，至今已經在許多模式生物如水稻(Oryza sativa)(Li et al.,2014)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和菊花(Chrysanthemum spp.)中得到了較好應用，而且此類技術無物種的限制性，為石蒜等非模式生物的重要次生代謝產物檢測提供了重要參考。

Sahar等(Sahar et al.,4’-O-Methylnorbelladine feeding enhances galanthamine and lycorine production by Leucojum aestivum L.shoot cultures，Engineering in Life Sciences，00：1-6，2015)采用HPLC-ESI-MS的方法，對夏雪片蓮芽中的加蘭他敏和石蒜堿進行定量分析，采用梯度洗脫，梯度洗脫前期和后期都需要很長的分析時間，檢測程序時長為36min，加蘭他敏的洗脫時間為33min，HPLC分析時間相對較長，大約需要36分鐘，其根據保留時間和母離子信息進行含量檢測，此方法較Quan等的方法，準確性有所提升，但明顯的缺陷在于，相同洗脫時間和母離子大小的物質成分可能有很多種，因此在定性定量準確性上仍有缺陷。