[發(fā)明專利]一種碘克沙醇密度梯度離心純化蟲卵的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010047335.4
• 申請(qǐng)日: 2020-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN111154653B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曲自剛;蔡建平;王恒;汪靖;張昆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/10
• 分類號(hào): C12N1/10;C12N1/02;A01K67/033;C12R1/90
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

本發(fā)明涉及一種碘克沙醇密度梯度離心純化蟲卵的方法，屬于蟲卵純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述方法包括以下步驟：1)將含蟲卵樣品進(jìn)行破碎和均質(zhì)；2)將勻漿與次氯酸鈉水溶液混合進(jìn)行消化，過(guò)篩，得到濾液；3)將濾液進(jìn)行離心，得到的沉淀用飽和食鹽水進(jìn)行懸浮，離心，得到上清液；4)將上清液與水混合，離心，得到第一沉淀；5)將第一沉淀和次氯酸鈉水溶液混合，在冰上放置，離心，得到第二沉淀；6)將第二沉淀溶于TE緩沖液中，得到TE蟲卵懸浮液，進(jìn)行碘克沙醇密度梯度離心，得到純化蟲卵。本發(fā)明所述方法能夠從糞便和盲腸內(nèi)容物中純化出高純度蟲卵，這些高純度蟲卵可進(jìn)一步用于體外培養(yǎng)、疫苗研發(fā)和分子生化研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蟲卵純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種碘克沙醇密度梯度離心純化蟲卵的方法。

背景技術(shù)

當(dāng)前球蟲蟲卵純化方式有飽和食鹽水、蔗糖溶液和Percoll密度梯度離心等方式。飽和食鹽水純化不能得到特別純凈的球蟲卵囊，里面容易混雜有雜質(zhì)。僅可用于粗提純卵囊。Percoll梯度溶液的缺點(diǎn)是常常需要在分析前去除膠體硅顆粒，用沉降法來(lái)去除膠體硅也會(huì)由于卵囊進(jìn)入形成的膠狀沉淀中而造成損失，如果需要去除溶質(zhì)，可在純化的卵囊不損失的情況下，只用兩倍體積緩沖液稀釋過(guò)后就可從梯度收集中沉降下來(lái)。

迄今為止，缺乏有效的簡(jiǎn)便操作方式來(lái)純化蟲卵囊，現(xiàn)有方法存在雜質(zhì)污染，或者純化手段需要超速離心機(jī)儀器或制備濃度梯度較為繁瑣，或不能完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的純度要求，如基因組測(cè)序和疫苗研發(fā)等分子生物學(xué)領(lǐng)域，因此亟待需要一種簡(jiǎn)便快速獲得高度純化的球蟲卵囊的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種碘克沙醇密度梯度離心純化蟲卵的方法。本發(fā)明所述方法能夠從糞便和盲腸內(nèi)容物中高效純化出高純度蟲卵，這些高純度蟲卵可進(jìn)一步用于體外培養(yǎng)、疫苗研發(fā)和分子生化(基因組、蛋白質(zhì)測(cè)序)研究。

本發(fā)明提供了一種碘克沙醇密度梯度離心純化蟲卵的方法，包括以下步驟：

1)將含蟲卵樣品進(jìn)行破碎和均質(zhì)，得到勻漿；

2)將步驟1)得到的勻漿與次氯酸鈉水溶液混合進(jìn)行消化，依次過(guò)60目、100目和200目篩，得到濾液；

3)將步驟2)得到的濾液進(jìn)行第一離心，得到的沉淀用飽和食鹽水進(jìn)行懸浮，第二離心，得到上清液；

4)將步驟3)得到的上清液與水混合，第三離心，得到第一沉淀；

5)將步驟4)得到的第一沉淀和次氯酸鈉水溶液混合，在冰上放置20～30min，第四離心，得到第二沉淀；

6)將步驟5)得到的第二沉淀溶于TE緩沖液中，得到TE蟲卵懸浮液，將TE蟲卵懸浮液進(jìn)行碘克沙醇密度梯度離心，所述碘克沙醇密度梯度離心為依次加入等體積的ρ＝1.121的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液、ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液和TE蟲卵懸浮液，12,000g 4℃離心60min，取ρ＝1.089的碘克沙醇水溶液和ρ＝1.058的碘克沙醇水溶液之間出現(xiàn)的均一的條帶，得到純化蟲卵。

優(yōu)選的是，步驟1)所述含蟲卵樣品包括含蟲卵的糞便和/或盲腸內(nèi)容物。

優(yōu)選的是，所述蟲卵包括球蟲蟲卵、蠕蟲蟲卵或原蟲蟲卵。

優(yōu)選的是，所述第一離心和第三離心的條件為3000rpm，10min，所述第二離心的條件為2000rpm，10min，所述第四離心的條件為12000rpm，5min。

優(yōu)選的是，步驟2)和步驟5)所述次氯酸鈉水溶液中次氯酸鈉的質(zhì)量百分含量獨(dú)立的為10～20％。

優(yōu)選的是，步驟3)后，當(dāng)雜質(zhì)較多時(shí)，還包括重復(fù)步驟3)的離心、懸浮和離心操作。

優(yōu)選的是，步驟4)所述上清液與4～5倍體積的水混合。