[發明專利]非人靈長類食蟹猴乙型肝炎病毒效應T細胞特異的抗原多肽及疫苗

有效

• 申請號: 201710537720.5
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107325160B
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 趙樹立;張雪峰;王靜;吉金子;米瓊宇
• 申請（專利權）人: 江蘇鼎泰藥物研究股份有限公司
• 主分類號: C07K14/02
• 分類號: C07K14/02;G01N33/68;G01N33/569;A61K39/29;A61P31/20
• 代理公司: 南京九致知識產權代理事務所(普通合伙) 32307
• 代理人: 王培松;齊棠

本發明屬于生物醫藥領域，公開了一種非人靈長類食蟹猴乙型肝炎病毒效應T細胞特異的抗原多肽及其在診斷試劑盒上的應用和疫苗。通過對乙型肝炎病毒功能蛋白結構的拓撲構像分析，得出非人靈長類乙型肝炎病毒效應T細胞特異的多肽，隨后對相關多肽組合重排后的結構分析，篩選出能用于非人靈長類乙型肝炎疾病診斷的全新肽段。在ELISpot實驗中，利用得到的肽段通過刺激乙型肝炎感染的非人靈長類疾病中的效應T細胞分泌γ?IFN，證實了該肽段在此類疾病診斷中的可行性和治療價值。該方法特異性強，靈敏度高，操作簡便，可發展成為診斷試劑盒用于臨床檢測靈長類動物的乙型肝炎診斷和鑒別診斷，為人畜共患病的篩查和治療奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于醫學免疫學診斷技術領域，涉及一種非人靈長類食蟹猴乙型肝炎病毒效應T細胞特異的抗原多肽及其在診斷試劑盒上的應用和疫苗，具體涉及運用ELISpot方法對非人靈長類食蟹猴乙型肝炎病毒感染進行診斷。

背景技術

乙型肝炎在發展中國家發病率較高，世界60億人口，有2.5億人是乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者，并誘發肝細胞癌(HCC)，也是一種傳染性嚴重的人畜共患病。HBV發現以來，在野生嚙齒動物、野生鳥類和非人靈長類中已經相繼分離出多種與此相關的嗜肝病毒，這幾種動物病毒與人類乙型肝炎病毒組成一個獨特的嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。目前已經發現的非人靈長類動物HBV株有，猩猩HBV株(Warren，1999),長臂猿HBV株(Norder,1996),黑猩猩HBV株(MacDonaid,2000)等。這些病毒株在DNA序列和蛋白結構上不同于其它野生動物嗜肝病毒毒株，它們與人乙型肝炎病毒株極其相似，病毒形態與乙型肝炎病毒(HBV)相似。一些研究表明，非人靈長類嗜肝病毒感染后，其病毒形態與人HBV相似，經HBV表面抗原(HBsAg)試驗，結果在表面抗原陽性的血清包含其病毒的DNA聚合酶，并具有活性。這些說明乙型肝炎病毒表面抗原與非人靈長類嗜肝表面抗原結構相似，存在交叉反應。因此，非人靈長類HBV的研究對人類乙型肝炎的診斷和治療具有重要意義。

非人靈長類動物(黑猩猩、長臂猿，食蟹猴，恒河猴等)可以感染HBV，且感染的HBV基因型與感染人類的基本一樣，其感染HBV后的血清學和肝臟病理組織學改變與人較接近。HBV只有3200bp，是一個相當小的病毒。其基因組共有四個ORF，編碼以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白(L，M，S)。Core是核衣殼蛋白；Pre-core現在不知道有何功能，它對病毒的復制不是必要的，但是可能與抑制宿主的免疫反應有關；X蛋白對病毒復制是重要的，還與肝癌的發生有關；S蛋白是病毒的包膜蛋白，與病毒進入細胞有關。HBV的抗原有3種：表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。表面抗原大量存在于感染者血液中，是HBV感染以及檢測的主要標志。核心抗原由183個或185個氨基酸組成，高度磷酸化，具有強免疫原性，可誘導很強的體液免疫和細胞免疫，刺激機體產生抗體。

1983年建立的酶聯免疫斑點實驗(Enzyme-linked Immunospot，ELISpot)技術具有高度的敏感性和應用的廣泛性，已成為免疫檢測抗原特異性免疫反應的重要檢測手段之一。

在運用4個氨基酸的多肽疊加依次進行HBV蛋白的免疫原性分析發現，HBV不同的肽段對T細胞的免疫原性不同，其中核心蛋白(65-75和86-95)和聚合酶功能區蛋白(385-391和401-411)氨基酸均具有較強的T細胞免疫原性。本發明即是結合HBV抗原結構特點，根據軟件對這些選出的氨基酸序列進行抗原性分析和二級結構預測，把其細胞免疫原性強的多肽重新組合成兩段多肽序列，構建出非人靈長類HBV病毒效應T細胞特異的抗原多肽，利用ELISpot方法對HBV的非人靈長類疾病進行診斷和治療。

發明內容

本發明的目的是提供一種非人靈長類食蟹猴乙型肝炎病毒效應T細胞特異的抗原多肽，用于檢測非人靈長類HBV感染后外周血中分泌的特異性γ-IFN的T細胞，提高非人靈長類HBV的靈敏度和特異性，輔助人畜共患病的診斷和鑒別診斷。