[發(fā)明專利]具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚(yú)提取物的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710528629.7
• 申請(qǐng)日: 2017-07-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107267583A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浦江縣泰如食品科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;C07K1/16;C07K1/30;C07K1/34
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及保健品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚(yú)提取物的制備方法。

背景技術(shù)

眾所周知，惡性腫瘤已成為威脅人類健康的主要疾病，其治療也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的化療和放療在治療的同時(shí)，也產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。腫瘤的生物治療是繼傳統(tǒng)療法的第四種治療手段，目前的研究已證實(shí)，生物治療在腫瘤的治療中發(fā)揮著愈來(lái)愈大的作用，并有望成為攻克腫瘤的療法。

多肽從二十世紀(jì)初才開(kāi)始受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)它區(qū)別于蛋白質(zhì)區(qū)別于氨基酸，具有藥物的作用。到了上個(gè)世紀(jì)九十年代才有了長(zhǎng)足發(fā)展，在不斷更新的技術(shù)指導(dǎo)下，多肽的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，作用也越來(lái)越大，這才邁進(jìn)了我們的生活，在我們生活中占據(jù)的份額越來(lái)越大，多肽類藥物高效低毒特異性強(qiáng)具有區(qū)別于其他藥物的特有優(yōu)勢(shì)，正不斷影響著我們的生活。而且多肽潛力巨大，是生物科學(xué)發(fā)展的又一大突破和發(fā)展方向。

天然存在的海洋活性多肽由于在生物體中含量低，而且提取困難，難以實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)供給所需，化學(xué)人工合成多肽成本昂貴。所以，人們更多地把目光投向開(kāi)發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物獲得活性多肽這條途徑上來(lái)。由于海洋生物生存的環(huán)境與陸地生物完全不同，如高壓、低溫、高溫和高鹽等極端環(huán)境，為了適應(yīng)這些極端的海洋生物環(huán)境，海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，同時(shí)，海洋生物蛋白資源無(wú)論在種類和數(shù)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陸地蛋白資源，并且未得到很好的開(kāi)發(fā)。種類繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解，就釋放出有活性的肽段。海洋生物蛋白資源是21世紀(jì)人類重要的蛋白類食物及生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源。我國(guó)目前的海洋生物蛋白資源總量在世界各國(guó)名列前茅，但我國(guó)目前的蛋白類水產(chǎn)品中，除一部分直接食用外，大部分通過(guò)簡(jiǎn)單的加工技術(shù)制成食品進(jìn)入市場(chǎng)，加工技術(shù)落后，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，產(chǎn)品的附加值低，使得產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力較差。因此，我國(guó)急需對(duì)海洋生物蛋白資源進(jìn)行優(yōu)化利用和高值化加工。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為CN103333940B的中國(guó)發(fā)明專利，公開(kāi)了一種利用帶魚(yú)制備二肽基肽酶IV抑制肽的方法，步驟包括：將帶魚(yú)加水絞碎成均勻的魚(yú)肉漿；魚(yú)肉漿放入酶解罐中，添加內(nèi)切蛋白酶，攪拌水解4～12h，得水解液；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；將水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，攪拌水解2～8h；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；內(nèi)切蛋白酶為木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶中的一種。外切蛋白酶為Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶。將上述所得滅酶后的水解液離心取上清液；將上清液加入到超濾膜分離器中，調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0.05～0.1MPa，超濾膜的截留分子量為3000Da，收集超濾膜透過(guò)液；采用親和層析方法分離純化DPP-IV抑制肽。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，上述方法采用陸地上提取的蛋白酶對(duì)海洋生物進(jìn)行酶解，酶解效率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種采用從海洋生物中提取的蛋白酶酶解金槍魚(yú)蛋白，從而得到具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚(yú)提取物的制備方法，制備得到的金槍魚(yú)提取物能有效抑制癌細(xì)胞DNA的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：具有抑制癌細(xì)胞作用的金槍魚(yú)提取物的制備方法，包括復(fù)合酶酶解、等電點(diǎn)沉淀、超濾和納濾、HPLC洗脫和冷凍干燥；復(fù)合酶酶解步驟為采用海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶酶解金槍魚(yú)魚(yú)肉勻漿液，并采用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶同時(shí)對(duì)金槍魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段。

作為優(yōu)選，金槍魚(yú)提取物中含有氨基酸序列為HSHACASYYCRCLVLHPCVNCYCRCSR的活性短肽。上述活性短肽可有效抑制癌細(xì)胞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，從而抑制癌細(xì)胞DNA的復(fù)制，使癌細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂間期；并且能促進(jìn)E-鈣黏蛋白的分泌，降低癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而降低其轉(zhuǎn)移的速度。

作為優(yōu)選，復(fù)合酶酶解步驟中海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的加入量為1~2wt%，酶解溫度為25~35℃，pH為7.0~9.0，酶解時(shí)間為50~70min。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，金槍魚(yú)蛋白上有大量海洋氧化短桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和裙帶菜蛋白酶的酶切位點(diǎn)，酶解后可得到大量長(zhǎng)短不同的肽鏈，酶解效率高。