[發明專利]一種建蘭花葉病毒抗體親和填料及其制備方法

在審

• 申請號: 201710526035.2
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107091928A
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: 鄭國華;明艷林;張文珠;林德欽;劉韶松;鄭志忠
• 申請（專利權）人: 廈門華僑亞熱帶植物引種園
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司11212
• 代理人: 談杰

技術領域

本發明涉及用于從抗血清中純化建蘭花葉病毒高特異性抗體的一系列親和填料及其制備方法，屬于蛋白分離技術領域和免疫學檢測技術領域。

背景技術

建蘭花葉病毒是主要危害蘭花的一種病毒，能夠導致蘭花出現花葉、環斑、花朵畸形和植株早衰等癥狀，嚴重影響了蘭花的觀賞價值和經濟價值，被許多國家和地區列為檢疫對象。目前該病毒的檢測主要采用間接ELISA和雙抗夾心ELISA等血清學技術，這些技術的準確性主要依賴于檢測抗體(IgG)的特異性。

檢測抗體主要來源是通過將病毒作為免疫原注射到兔、羊、鼠等哺乳動物，從而誘發動物產生特異結合病毒的抗體。進一步采集得到的動物血清就含有大量的病毒抗體，可用于一般的檢測工作。不過，為進一步提高抗體特異性，就有必要通過抗體純化步驟進一步提高抗體的濃度和降低非抗體蛋白的含量。

目前能夠用于抗體純化的技術包括：鹽析法、辛酸沉淀法、離子交換法和親和層析法等。其中最常用的是親和層析法，該方法是利用受體與配體、抗體與抗原的特異性識別結合富集目標產物，其優點是可以通過簡單的處理得到純度較高的目標產物。抗體的親和層析可以使用Protein A、Protein G、抗抗體、抗原等作為配基制備親和填料，最常見的是采用蛋白A或蛋白G作為配基制備親和填料。其中蛋白A是金黃色葡萄球細胞壁上的一種蛋白質，能夠特異性地與哺乳動物抗體(主要是IgG)的Fc區結合，蛋白G是鏈球菌細胞壁蛋白，能夠與抗體IgG的恒定區、清蛋白、α2-巨球蛋白結合。因此，利用蛋白A、蛋白G的親和填料純化得到的抗體屬于混合抗體，這種抗體的特異性較差。

采用蛋白A、蛋白G親和層析純化抗體的典型方法如下：(1)通過功能試劑修飾在填料表面形成NH2或COOH基團，通過戊二醛或雙功能基團進一步修飾NH2或COOH得到活化填料；(2)將純化的蛋白A或蛋白G加入活化填料中，通過共價鍵結合到填料，制備得到親和填料；(3)使抗血清粗溶液經過固定蛋白A貨蛋白G的填料，使IgG吸附到填料上；(4)用中性的緩沖液沖洗填料，去除其他雜質；(4)使用酸性緩沖液(pH2.5～pH3.0)洗脫吸附在填料上的IgG；(5)調整洗脫液pH值至中性，得到純化的IgG。

另外，還可以采用抗原作為配基制備親和填料，應用于抗體純化可以得到親和力好、特異性強、純度高的抗體。發明(2015103209206)將變性抗原蛋白(如原核表達的包涵體蛋白)直接偶聯在固相載體以純化抗體,簡化了操作步驟,即制備可溶性抗原蛋白過程，所得抗體具有極高的純度和特異性,適合于實驗室制備和工業生產中應用。文獻封琳等豬瘟病毒抗原與環氧氯丙烷活化的Sepharose-4B偶聯，制備成免疫親和層析柱用于該病毒抗體的純化，得到純度高、活性強的病毒抗體。不過，由于采用的是全抗原，純化得到的抗體識別也屬于混合抗體，無法用于病原體株系、分離物的準確鑒定。

近年來，人們隨著研究工作的深入，發現侵染蘭花的建蘭花葉病毒存在大量的株系、分離物的變異，這些變異導致不同株系的致病性存在較大差別，其中強致病株能夠導致更嚴重的病癥，而弱病毒影響蘭花程度較低。再者，隨著研究的進一步深入，人們還發現弱病株感染后的蘭花能夠減緩強病株的感染危害，存在一定程度的交叉保護作用；另一方面，人們還從蘭花病株上發現許多未知的病毒種類，其中有部分和建蘭花葉病毒非常相似，一直被當作該病毒進行防治，導致防治工作事倍功半。可見，準確鑒定病毒和病毒株系對于防治工作至關重要，現有抗體的純化技術無法對抗體進行更細致的純化，。

鑒于此本發明提供了一種能夠用于從抗血清中純化特異性抗體的一系列多肽配基親和介質，滿足抗體純化的需要。

發明內容

本發明的目的是提供一種建蘭花葉病毒抗體親和填料及其制備方法，其可以滿足抗體純化的需要。

本發明采用以下技術方案：

一種建蘭花葉病毒抗體親和填料的制備方法，采用氨基硅烷對填料表面進行修飾、原位合成連接臂后，進一步修飾的配基是建蘭花葉病毒外殼蛋白不同區域的多肽片段，使填料能夠吸附外殼蛋白不同區域的特異性抗體。

所述多肽片段為選擇位于病毒特異保守區的片段，進一步分析這些片段氨基酸殘基的親水性、表面可及性和抗原性。

多肽片段為包括CP蛋白N端至C端，最短為6個氨基酸長度、最長為30個氨基酸長度的一系列多肽片段。

所述的多肽配基對應于建蘭花葉病毒外殼蛋白不同區域的多肽片段，長度為6-30個氨基酸殘基。