[發(fā)明專利]利用異養(yǎng)培養(yǎng)平滑菱形藻生產(chǎn)巖藻黃素的方法

在審

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• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107099564A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設計）人: 陳峰;盧雪;劉賓
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12P17/02
• 分類號: C12P17/02;C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 石家莊海天知識產(chǎn)權代理有限公司13101
• 代理人: 田文其

技術領域

本發(fā)明屬于微生物的培養(yǎng)，特別是指一種利用異養(yǎng)培養(yǎng)平滑菱形藻生產(chǎn)巖藻黃素的方法。

背景技術

巖藻黃素(Fucoxanthin)，又稱巖藻黃質(zhì)、褐藻素，主要來自大藻、硅藻及金藻等大型海藻和微藻，是一種天然的類胡蘿卜素，參與光合作用中光系統(tǒng)II的反應。因其具有獨特的丙二烯結構，巖藻黃素是一種具有強抗氧化性的活性分子。近年來研究發(fā)現(xiàn)，巖藻黃素在細胞、動物以及人體都證實具有多種功能活性，包括抗氧化、抗炎癥、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、抗血管生成和抗瘧等生理活性，且對肝臟、腦部血管、骨骼、皮膚和眼睛等器官具有保護作用。綜合以上功能，巖藻黃素是一種具有廣闊保健食品和藥物開發(fā)前景的天然產(chǎn)物，巖藻黃素的市場容量500噸，10％含量的巖藻黃素浸膏價格即高達40000元/公斤，因此具有巨大的市場價值。

巖藻黃素的功效中減肥方面的顯著作用使其受到越來越多的關注，它可以通過抑制脂肪細胞的生成和加速脂肪分解代謝兩條途徑達到減肥的效果。目前市場上巖藻黃素主要是通過裙帶菜(Undariapinnatifida)、海帶(Laminaria japonica)等大型海藻中提取獲得。但是上述方法存在著大型海藻在細胞壁厚、多糖類物質(zhì)含量高、純化困難和海洋污染等問題，且大型海藻中巖藻黃素含量極低(僅為干重的0.01％-0.07％)，綜上所述，巖藻黃素的產(chǎn)品質(zhì)量在一定程度上難以保證，并且下游分離純化的難度加大，因其對提取分離純化有更高的技術要求，從而導致高純巖藻黃素價格昂貴，進一步限制了巖藻黃素的應用。

相對大型海藻而言，海洋微藻是巖藻黃素更好的替代來源。目前市場上大型海藻中提取的濃縮巖藻黃素的含量普遍低于1％，而一些海洋微藻細胞中巖藻黃素含量即高達0.6％，是大型海藻的近100倍。硅藻為分布廣泛的海洋微藻，在海洋、淡水及潮濕的表面上均廣泛存在，一般依靠光能合成自身所需的養(yǎng)分。平滑菱形藻(Nitzchia laevis)為一種單細胞藻類，屬于硅藻門(Bacillariophyta)。

研究發(fā)現(xiàn)舟形藻屬、小環(huán)藻屬、筒柱藻屬等硅藻可異養(yǎng)培養(yǎng)生長，本申請中的設計人發(fā)現(xiàn)其生物量濃度極低，較難應用于高密度異養(yǎng)發(fā)酵(Guo,et al.,2016)。平滑菱形藻(Nitzchia laevis)是一種單細胞藻類，屬于硅藻門(Bacillariophyta)，羽紋硅藻綱(Pennaeae)，雙菱藻目(Surirellales)，菱形藻屬(Nitzschia)，具有異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的潛力。利用平滑菱形藻生產(chǎn)巖藻黃素的研究較少。申請人經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)申請?zhí)枮?01310329269.X的專利文獻中公開了一種提高硅藻中巖藻黃素產(chǎn)率的培養(yǎng)方法，該專利過優(yōu)化培養(yǎng)基，添加番茄提取物在一定程度上促進合成了巖藻黃素，后期采用光照處理最終使得小環(huán)藻達到7.77mg/(L·d)的巖藻黃素產(chǎn)率，其中提出平滑菱形藻可用于光照培養(yǎng)生產(chǎn)巖藻黃素，但是該文獻僅公開了利用小環(huán)藻制備巖藻黃素的方法、步驟及工藝條件。并未公布采用其他菌種可進行巖藻黃素的生產(chǎn)，同時其中也并未相關的培養(yǎng)條件、光照強度、培養(yǎng)基組成、生物量濃度等培養(yǎng)結果以及巖藻黃素含量和產(chǎn)率等一系列關鍵技術信息。本申請的設計人等利用異養(yǎng)手段培養(yǎng)平滑菱形藻，巖藻黃素含量僅為0.4％左右，巖藻黃素產(chǎn)率僅為0.1mg/(L·d)。然而平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047在光照自養(yǎng)條件下生產(chǎn)巖藻黃素，其含量(占細胞干重)高達0.7％，但生物量濃度<0.2g/L，產(chǎn)率僅為0.06mg/(L·d)，而此論文中并未對其進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化(Guo,et al.,2016)。因此有必要通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件等技術手段，提高異養(yǎng)條件下平滑菱形藻的生物量濃度和巖藻黃素產(chǎn)率，同時進一步提高巖藻黃素含量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用異養(yǎng)培養(yǎng)平滑菱形藻生產(chǎn)巖藻黃素的方法，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件能夠實現(xiàn)高產(chǎn)制備巖藻黃素。

本發(fā)明的整體技術構思是：

利用異養(yǎng)培養(yǎng)平滑菱形藻生產(chǎn)巖藻黃素的方法，包括如下步驟：

A、種子液的制備

將活化好的平滑菱形藻置于無菌種子培養(yǎng)基中異養(yǎng)培養(yǎng)3-11天制成種子液，使平滑菱形藻細胞處于對數(shù)生長期；

B、發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟A中的種子液按照體積比為3％-20％的接種量轉接入無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)制備發(fā)酵液，培養(yǎng)溫度20℃-30℃，培養(yǎng)周期3-11天；

所述的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下含量范圍的原料：