[發明專利]利用高效液相色譜?熒光檢測（HPLC?FLD）法分析測定燕麥生物堿

在審

• 申請號: 201710520315.2
• 申請日: 2017-06-30
• 公開（公告）號: CN107643344A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 任虹;蘭社益;謝佳穎;朱帥;萬慧潔;陳陽
• 申請（專利權）人: 北京工商大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及利用高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FLD)法分析檢測燕麥生物堿。燕麥生物堿是一系列N-(肉桂酰)鄰氨基苯甲酸類化合物，研究發現，燕麥生物堿提取物具有抗氧化、降血脂、抑制腫瘤細胞增殖、消炎止癢等功能，廣泛應用于藥品、功能保健品及化妝品領域，但目前沒有高效靈敏的檢測分析燕麥生物堿的方法，也沒有從燕麥中分離純化得到燕麥生物堿單體化合物，燕麥生物堿檢測分析方法的不完善嚴重阻礙了燕麥生物堿的開發利用，因此，燕麥生物堿的分析檢測方法亟待解決。

背景技術

曲尼司特是燕麥生物堿的結構類似物，其化學結構式為N-(3，4-二甲氧基肉桂酰)鄰氨基苯甲酸，是一種淡黃色粉末。我們以曲尼司特作為標準參照物，探索N-(肉桂酰)鄰氨基苯甲酸類化合物的分析檢測方法。

現有檢測曲尼司特的方法有兩種：紫外分光光度法、高效液相-紫外檢測(HPLC-DAD) 法。兩種方法都基于曲尼司特的紫外吸收特性，即在330nm下有最大吸收值，但母核側鏈上的生色團與助色團會明顯影響其紫外吸收，且光譜信息在紫外-可見光譜范圍重疊現象嚴重，都會造成誤差，可見，單純依靠單一檢測方法分析曲尼司特具有很大局限性。

本發明的目的是定量分析檢測燕麥生物堿，利用該類化合物的熒光特性，以燕麥生物堿的結構類似物曲尼司特作為標準參照物，利用高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FLD)技術定量分析檢測曲尼司特，利用HPLC-FLD的熒光強度量化曲尼司特濃度，建立曲尼司特 HPLC-FLD的標準曲線，以此來定量分析燕麥生物堿含量。

發明內容

本發明所要解決的問題是檢測分析燕麥生物堿。

本發明涉及檢測分析燕麥生物堿的方法及其應用，其特征是基于燕麥生物堿的熒光特性，以燕麥生物堿的結構類似物曲尼司特作為標準參照物，建立HPLC-FLD技術定量分析燕麥生物堿的方法。

附圖說明

1、曲尼司特是燕麥生物堿的結構類似物，見圖1.

2、曲尼司特的熒光性質

圖2是曲尼司特在激發波長330nm，38％和50％濃度下的發射全波長圖，顯示了曲尼司特的熒光特性，即在激發波長330nm下產生430nm發射光。

3、曲尼司特的熒光穩定性：

配制0.1mg/mL曲尼司特溶液，在室溫、不避光條件下保存，HPLC-FLD法分析其在40 天內的熒光強度變化，確定其穩定性。表1給出曲尼司特的熒光穩定性。

表1 曲尼司特的穩定性(0.1mg/mL)

4、確定HPLC-FLD定量檢測分析曲尼司特的方法

用乙醇配制0.1mg/mL曲尼司特樣品溶液進行HPLC-FLD，流動相為62％水(含10mM 乙酸)和38％乙腈等梯度洗脫20min，柱溫30℃，進樣量10μL，熒光檢測條件是激發波長 330nm、發射波長430nm，如圖3所示，圖4是曲尼司特在330nm下的HPLC-DAD圖譜。

5、繪制曲尼司特標準曲線

在激發波長330nm、發射波長430nm條件下，利用HPLC-FLD檢測分析曲尼司特。圖 5是在濃度范圍為10^-9～1.0mg/mL內，曲尼司特的熒光強度與濃度的關系，可見在0～0.1mg/mL 濃度內呈線性關系，圖6是曲尼司特的熒光強度與濃度的標準曲線圖。

6、檢測限

選取兩個低于標準曲線線性范圍最低濃度0.001mg/mL的曲尼司特溶液即0.0008mg/mL 和0.0009mg/mL進行HPLC-FLD測定，見表2，結果顯示0.0008mg/mL和0.0009mg/mL曲尼司特溶液對應的熒光值分別為19.3300EU和21.9327EU，均有明顯的響應信號，說明可以運用國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)對檢測限的定義計算。取k＝3，此時置信區間為99.6％；以乙醇溶液為空白對照樣品，在相同HPLC-FLD檢測條件下測定其20次，計算得空白信號的平均值和標準偏差s_b1；根據IUPAC定義計算檢測限：

式中，x_L——檢測限；——空白均值；k——與置信度有關的常數；s_b1——空白值標準偏差；c_L——最低檢出濃度；s——低濃度時的靈敏度，即標準工作曲線在低濃度范圍內的斜率。

表2 曲尼司特的檢測限

7、回收率