[發明專利]一種用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性檢測的熒光定量RT?PCR試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201710516979.1
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107236824A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 李曉菲;秦立廷;陳婷;魏笑笑
• 申請（專利權）人: 新希望六和股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，尤其涉及一種用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性檢測的引物對及探針、熒光定量RT-PCR試劑盒及應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種豬的高度傳染性疾病。它以母豬發熱、厭食和流產、死產、產弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征。1987年該病首先發現于美國，隨后暴發和流行于幾乎所有的養豬國家，引起了國際上的廣泛關注。1996年我國首次報導出現PRRS，此后在全國范圍內迅速傳播開來，2006年我國爆發高致病PRRS疫情，波及范圍廣，給養豬業造成了極其慘重的經濟損失。從2013年底開始，多個省份相繼發現了與美國NADC30毒株同源性很高的NADC30-like毒株，該毒株在nsp2區存在131個氨基酸的不連續缺失。流行病學調查研究表明，NADC30-like毒株在我國多個地區逐漸呈流行態勢。PRRS已成為危害我國養豬業的主要疫病之一。

目前PRRSV的常規檢測方法包括病毒分離與鑒定、間接免疫熒光抗體試驗(IFA)、血清中和試驗(SN)、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以及序列測定等。這些常規方法用于PRRSV檢測時在特異性、敏感性和時效性等方面存在不足，特別是在病毒感染早期診斷中體現得尤為明顯。實時熒光定量PCR將常規PCR與熒光探針檢測技術相結合，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優點，并且操作簡便，用時短，污染少，通過分析軟件可自動定量分析，結果更為準確直觀，適用于大批量的病毒定性和定量的檢測，已逐漸成為病原體檢測的重要方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒及應用。

為實現上述發明目的，本發明是通過如下措施實現的：一種用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性檢測的特異性引物對及探針，其中，所述特異性引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示：

上游引物：5' CCATGGAAACCTGGAGATTCA 3'

下游引物：5' GCGGCCTAGCAAGCACAA 3'；

所述探針序列如下所示：

5' FAM-CACCTCCAGATGCC-MGB 3'。

另外，本發明提供了用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒，其中，該試劑盒包括以下組分：反應混合液、水和特異性擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF6基因的特異性引物對和探針；

所述特異性引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示：

上游引物：5' CCATGGAAACCTGGAGATTCA 3'

下游引物：5' GCGGCCTAGCAAGCACAA 3'

所述探針序列如下所示：

5' FAM-CACCTCCAGATGCC-MGB 3'。

其中，所述反應混合液為購自TaKaRa公司的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。

其中，所述水為水是購自TaKaRa公司的RNase-free Water。

另外，本發明提供了所述的用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒在制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑中的應用。

其中，本試劑盒在PRRSV經典毒株、高致病性變異毒株以及NADC30-like毒株的應用。

本發明的有益效果為：根據GenBank中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）序列設計1對針對ORF6基因的引物和1條特異性TaqMan-MGB探針，建立了一種快速檢測PRRSV病毒載量的特異性TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法。通過對反應條件和反應體系的優化，使得該方法在101～108copies?μL-1模板范圍內具有良好的線性關系，靈敏度達到101copies?μL-1，是RT-PCR方法的100倍。而且與常規RT-PCR方法相比，該方法可對其結果進行實時監控，無需進一步進行凝膠電泳分析。試驗表明，該方法與其它豬病病毒無交叉反應，具有良好的特異性。將待檢樣品提取RNA反轉錄后，進行熒光定量PCR反應，利用所建立的熒光定量RT-PCR方法可以在2-3h內快速準確地對PRRSV進行檢測，既能進行定性檢測，又能準確定量，而且能夠同時檢測經典毒株、高致病性變異毒株以及NADC30-like毒株。

附圖說明