[發(fā)明專利]一種具有S-雌馬酚抗性的大腸桿菌突變株及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710516610.0
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107641611B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹業(yè)師;李海亮;陳華海;王燕玲;王欣
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種具有S?雌馬酚抗性的大腸桿菌突變株及應(yīng)用，所述具有S?雌馬酚抗性的大腸桿菌突變株是將來源于乳酸菌(Lactococcus sp.)20?92的L?DDRC、L?DZNR、L?DHDR和L?THDR基因克隆至大腸埃希氏菌BL21?G2中轉(zhuǎn)化得到；本發(fā)明提供一種發(fā)酵條件簡單、使用方便、體系穩(wěn)定、應(yīng)用廣泛且具有抗S?雌馬酚功能的大腸桿菌突變株，無論是在厭氧還是有氧條件下，均具有將LB培養(yǎng)基中的大豆素轉(zhuǎn)化為S?雌馬酚的能力，且本發(fā)明工程菌DDDT?G2是專利申請2014102431488中工程菌DDDT?BL21產(chǎn)雌馬酚量的1.25?2倍。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種突變工程菌的篩選與應(yīng)用，特別涉及一種具有抗S-雌馬酚功能的大腸桿菌突變株篩選及其在大豆素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)S-雌馬酚中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

S-雌馬酚是一種植物雌激素，是豆類食物在腸道中經(jīng)特定微生物轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，比其相應(yīng)的前體大豆異黃酮的生物活性更高。相比雌激素，S-雌馬酚與雌激素-β受體結(jié)合度更強(qiáng)，因此S-雌馬酚能預(yù)防各種具有雌激素依賴性的癌癥。大量的臨床研究表明豆類食物預(yù)防各種心血管疾病、婦女更年期綜合征、婦科癌癥和美白護(hù)膚等作用均歸咎于其代謝產(chǎn)物S-雌馬酚的生物學(xué)活性，故人體能否將大豆素代謝為S-雌馬酚是決定大豆能否發(fā)揮其抵御各種疾病的關(guān)鍵因素。然而科學(xué)研究報道，在常吃大豆類食物的亞洲僅只有30％-50％的人能將大豆代謝成雌馬酚，西方國家更低，所以雌馬酚在臨床預(yù)防各類疾病的作用愈加重要。

目前生產(chǎn)S-雌馬酚的方法主要為化學(xué)合成和微生物合成，其存在的兩個問題就是：(1)微生物大規(guī)模發(fā)酵合成雌馬酚時存在產(chǎn)物(S-雌馬酚)濃度過高從而抑制工程菌生長的局限性；(2)化學(xué)合成需要金屬催化劑、氫氣、高壓高溫等，對生產(chǎn)設(shè)備要求高、產(chǎn)量低、中間產(chǎn)物多、分離純化難、成本較高。所以能否采用生物法大規(guī)模合成S-雌馬酚成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)。對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前與本發(fā)明密切相關(guān)的專利有“一種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌及應(yīng)用”(申請?zhí)枺?01410243148.8)，“不動桿菌AUH-JLM455及其轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚的方法”(申請?zhí)枺?00810147314.9)，“雌馬酚產(chǎn)生菌及利用”(申請?zhí)枺?01080007863.1)，“含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物”(申請?zhí)枺?00480020952.4)，“含有維持了雌馬酚產(chǎn)生能力的雌馬酚產(chǎn)生微生物的發(fā)酵制品及其制備方法”(申請?zhí)枺?00980136848.4)，“一種奇異變形桿菌菌株及其轉(zhuǎn)化大豆素元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法”(申請?zhí)枺?01210146746.4)，“一種屎腸球菌及其產(chǎn)生雌馬酚的方法與應(yīng)用”(申請?zhí)枺?01110086803.X)和“一株降解大豆素原產(chǎn)生雌馬酚的雙酶梭菌及其菌劑和應(yīng)用”(申請?zhí)枺?01010513344.4)。以上這些專利均是使用從腸道中分離獲得的單一或少數(shù)幾種細(xì)菌混合厭氧發(fā)酵生產(chǎn)S-雌馬酚，但研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有微生物合成的方法有明顯缺陷，當(dāng)大規(guī)模生產(chǎn)雌馬酚時，產(chǎn)物雌馬酚濃度過高會抑制產(chǎn)雌馬酚工程菌的生長，這會很大程度限制生物合成法生產(chǎn)雌馬酚的轉(zhuǎn)化率和成本。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是針對目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中發(fā)酵產(chǎn)物S-雌馬酚具有抑制工程菌生長的不足，采用海洋轉(zhuǎn)座子突變文庫篩選的方法，獲得了一株具有S-雌馬酚抗性的大腸桿菌突變株G2。發(fā)現(xiàn)突變株G2比本底大腸桿菌BL21在利用大豆素發(fā)酵生產(chǎn)S-雌馬酚過程中具有生長速度更快、產(chǎn)量更高的優(yōu)勢。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：