[發(fā)明專利]一種具有S-雌馬酚抗性的大腸桿菌突變株及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710516610.0
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN107641611B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹業(yè)師;李海亮;陳華海;王燕玲;王欣
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種具有S-雌馬酚抗性的大腸埃希氏菌（Escherichia coli）突變株，其特征在于所述大腸埃希氏菌突變株是將來源于乳酸菌（Lactococcus sp.）20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大腸埃希氏菌（Escherichia coli）BL21 - G2轉(zhuǎn)化得到；所述L-DDRC的核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示、L-DZNR的核苷酸序列為SEQ ID NO：2所示、L-DHDR的核苷酸序列為SEQ ID NO：3所示，L-THDR的核苷酸序列為SEQ ID NO：4所示；所述大腸埃希氏菌（Escherichia coli）BL21 - G2保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 14219，保藏日期2017年6月5日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101。

2.一種權(quán)利要求1所述具有S-雌馬酚抗性的大腸埃希氏菌突變株在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用。

3.如權(quán)利要求2所述具有S-雌馬酚抗性的大腸埃希氏菌突變株在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以大豆素為底物，將具有S-雌馬酚抗性的大腸埃希氏菌突變株經(jīng)擴大培養(yǎng)獲得的種子液以體積濃度5%的接種量接種至LB培養(yǎng)基，在好氧或厭氧條件下，37℃培養(yǎng)24h，向培養(yǎng)液中加入終濃度25 mg/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6~72h后，取培養(yǎng)液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述LB培養(yǎng)基終濃度組成：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10 g/L，溶劑為蒸餾水，pH值為7.0；所述大豆素的初始濃度為50μg/ml。

4.如權(quán)利要求2所述具有S-雌馬酚抗性的大腸埃希氏菌突變株在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以大豆素為底物，將具有S-雌馬酚抗性的大腸埃希氏菌突變株經(jīng)擴大培養(yǎng)獲得的種子液以體積濃度5%的接種量接種至LB培養(yǎng)基，在好氧或厭氧條件下，37℃培養(yǎng)24h，向培養(yǎng)液中加入終濃度25 mg/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6~72h后，取培養(yǎng)液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述LB培養(yǎng)基終濃度組成：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10 g/L，溶劑為蒸餾水，pH值為7.0；所述大豆素的初始濃度為50μg/ml。

5.如權(quán)利要求3所述具有S-雌馬酚抗性的大腸埃希氏菌突變株在制備S-雌馬酚中的應(yīng)用，其特征在于所述培養(yǎng)液分離純化的方法為：取1ml的培養(yǎng)液，8000 r/min 離心3分鐘，獲得上清a；取900μl上清a至另一干凈的2 ml EP管中，然后向管中加入900 μl乙酸乙酯，充分混勻后靜置5min，5000 r/min 離心5分鐘，獲得上清b和沉淀b；取900 μl上清b至另一干凈的2 ml EP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重復(fù)離心1次，獲得上清c；將上清b和上清c混合在一起，移到2ml離心管中，45℃真空冷凍濃縮成粉末；加入200 μl 無水甲醇到該EP管溶解濃縮粉末，并經(jīng)0.22 μm聚偏氟乙稀微孔濾膜過濾，濾液即為S-雌馬酚。