[發明專利]RNAi干擾片段、干擾載體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710506560.8
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107267511B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 賈斌;李超程;杜迎春
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;A01K67/027
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒;劉鐵生

本發明提供了一種針對Zfx基因的RNAi干擾片段、干擾載體及其制備方法和應用。RNAi干擾片段至少包含下述序列一或序列二：序列一：F：5′?TGTGA GGACT ACCTT ATGAT TTCAA GAGAA TCATA AGGTA GTCCT CACTT TTTTC?3′；序列二：R：5′?TCGAG AAAAA AGTGA GGACT ACCTT ATGAT TCTCT TGAAA TCATA AGGTA GTCCT CACA?3′，所述的RNAi干擾片段用于干擾動物X染色體上的Zfx基因。本發明提供的干擾片段，可有效控制動物的性別。

技術領域

本發明涉及動物分子遺傳學領域，具體涉及能夠沉默X精子生成的相關基因的RNA干擾片段及其應用。

背景技術

在自然條件下，幾乎所有哺乳動物的性別比例都接近1∶1，從而實現了無間斷地進行穩定地繁衍后代，在自然的條件下達到生態平衡。對于畜牧生產實際而言，理想的性別比例具有十分重要的意義。利用泌乳、產蛋性狀進行生產的生產企業希望得到更多的雌性個體，而產肉、產毛性狀的在雄性個體上表現得優勢性更加明顯。一直以來，人類對控制動物后代的性別就有著極大的興趣。目前性別控制主要從受精前和受精后兩個方面進行，前者應用精子分離后再進行受精，使得在受精時就決定了后代的性別；后者采用早期胚胎性別鑒定，進行胚胎的性別篩選的方法來控制后代的性別。

哺乳動物性別決定理論認為，性染色體為“XX”的受精卵就能夠發育成雌性個體，而性染色體為“XY”的就會發育成雄性。那么從根本上講，控制家畜性別最理想的方法是先分離X、Y精子，然后再進行受精，就能人為地控制后代的性別，理論上這是在性別控制中最簡單、最經濟的途徑。自20世紀50年代后，關于精子分離的研究報告很多，這些研究都試圖利用X精子和Y精子不同的物理特性(體積、密度、電荷、運動性)，采用離心法、電泳法、離子交換法、細胞表面抗原法等不同的方法來實現精子的分離，但是都有一個共同的問題——可重復性差。而且這些差異隨著環境條件的不同而發生變化，因此，許多研究結果常常不一致，甚至出現相反的結論，致使兩類精子某些差異性研究存在爭議。到目前為止，除了X、Y精子DNA含量具有差異可以肯定之外，其他方面的差異表現很小，甚至難以確定。但是隨著分子生物學技術的不斷發展，以及研究工作的繼續深入，新的研究成果將會不斷涌現。

目前根據哺乳動物X、Y精子DNA含量差異的原理，利用流式細胞儀對X、Y精子進行分離，其分離效果較好，純度可達90％以上，但是其設備昂貴，分離速度較慢，而且受精的精子數量少、活力差等原因，遠遠不能滿足生產上對性控精液的大量需求。相比之下，如果能夠找到兩種精子發育或受精過程中，甚至胚胎發育時關鍵性的X、Y染色體的特異性mRNA序列，并結合當代新型的分子生物學技術利用RNA干擾(RNA Interference，RNAi)的方法則有望以較低的成本，簡便、快速地實現對動物的性別控制。

RNAi是一種轉錄后的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS)現象，通過體外人工合成或體內產生的雙鏈RNA(Dubble-stranded RNA，dsRNA)在細胞內特異性地降解其同源的mRNA，使得相應的基因干擾，實現阻止目標基因的表達。RNAi方法能夠快速、簡便、有效、特異性地下調細胞中的相應基因表達，它不但是研究基因功能的一種有力工具，而且也為特異性基因治療提供了新的技術手段，其應用前景十分廣闊。

在基因組、mRNA和蛋白水平的研究都證明，X、Y精子基因表達的確存在差異。基因表達檢測研究表明，在精子形成的減數分裂粗線期，為防止一些酶類與性染色體發生作用，兩條性染色體高度濃縮形成性體。性體的形成保護了性染色體，性染色體上特殊基因的表達被關閉。因此，哺乳動物成熟精子中沒有mRNA的轉錄，然而哺乳動物成熟精子中卻含有mRNA，這種差異來自精子發生過程中的轉錄，其翻譯遠落后于轉錄。這些mRNA是精子成熟后指導合成一些必須的蛋白，或者是受精后對卵母細胞mRNA庫的補充，或作為RNAi對生育和胎兒生長發育起著關鍵的作用。