[發明專利]在基因打靶中具有高突變效率的PL?LbCpf1?RR基因及其應用

在審

• 申請號: 201710505888.8
• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN107142271A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 魏鵬程;楊劍波;許蓉芳;李浩;李莉;秦瑞英;李娟
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

技術領域

本發明涉及生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種在基因打靶中具有高突變效率的PL-LbCpf1-RR基因及其在水稻基因打靶方面的應用。

背景技術

作物分子育種的關鍵是高效定向的創制基因突變材料。Cpf1是最近發現的一種位點特異性核酸酶，CRSIPR/Cpf1系統是存在于細菌中的一種先天性免疫系統。Cpf1能夠獨自地對crRNA前體進行加工，然后利用成熟的crRNA特異性的識別和剪切DNA。利用這一原理，在真核生物細胞中，通過人工合成帶有與Cpf1結合和特異識別靶位點的crRNA，同樣可以引導 Cpf1切割基因組中的靶點序列，在細胞啟動DNA修復機制后，切割位點會出現隨機的堿基插入或缺失，從而實現了位點特異性的基因打靶。在水稻，擬南芥，煙草等植物中，通過工程化改造Cpf1，同樣可以實現植物基因組特定位點的高效突變。例如，利用工程化的FrancisellanovicidaCpf1可在水稻葉型決定基因Drooping leaf編碼區引入靶向突變，造成目標水稻葉片斜披。而利用來源于Lachnospiraceae bacterium菌的Cpf1(LbCpf1)則可高效編輯水稻葉綠素合成相關基因Phytoenedesaturase編碼區引入靶向突變，造成目標水稻葉色改變。

目前植物中有三種Cpf1，FnCpf1，LbCpf1和來源于Acidaminococcus sp. BV3L6的AsCpf1在經工程化改造后可有效作用，而其中效率最高的是LbCpf1。LbCpf1可有效識別基因組中的TTTV(V＝A/C/G)序列作為PAM，從而靶向其下游序列。相對于Cas9識別的NGG PAM，基因組中TTTV的數量明顯偏少，造成LbCpf1可編輯數量受限。

但是，目前還沒有一種通用可行的提高LbCpf1可編輯位點數量并且能夠提高LbCpf1基因在作物基因打靶中的突變效率的方法，而且現有的高突變效率的LbCpf1基因數量有限。因此，能夠提供更多的在作物基因打靶中提供更多編輯位點的LbCpf1基因是人們迫切希望的，但是這樣的基因往往是可遇而不可求的，沒有成形的理論或方法能夠為人們找到這樣的基因提供理論依據。

發明內容

針對上述問題，本發明希望提供一種在作物基因打靶中具有較多編輯位點并且具有較高突變效率的LbCpf1基因。

具體而言，在第一個方面，本發明提供一種新的高突變效率 PL-LbCpf1-RR基因，命名為PL-LbCpf1-RR，所述PL-LbCpf1-RR基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

優選地，該基因由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列構成。

在第二個方面，本發明提供一種含有所述PL-LbCpf1-RR基因的植物表達載體。該植物表達載體的構建方法是利用NotI/SacI酶切位點，用 NotI/SacI酶切pHUN600載體并回收，由于合成的PL-LbCpf1-RR序列兩端加有NotI/SacI酶切位點，可以利用T4連接酶將PL-LbCpf1-RR連接到 pHUN600載體，得到植物表達載體pHUN-PL-LbCpf1-RR(pHUN 6a11)。

另一方面，本發明在表達載體的基礎上，根據實驗的實際需要，構建相應的基因打靶載體。

另一方面，本發明提供一種表達盒，其特征在于，所述表達盒中包含上述的PL-LbCpf1-RR基因。

另一方面，本發明提供一種上述基因、表達盒或載體的應用，其特征在于，所述應用包括利用所述在基因打靶中具有高突變效率的 PL-LbCpf1-RR基因完成水稻體內DNA雙鏈的剪切，并在自身修復系統的作用下，獲得帶有突變位點的轉基因植物或植物部分。

在另一個方面，本發明提供一種利用pHUN-PL-LbCpf1-RR(pHUN 6a11)表達載體(其含有所述PL-LbCpf1-RR基因)，在表達載體的基礎上只需進行簡單的退火、酶切連接作用即可獲得特異基因的打靶載體(pHUN 6a11-PDS)，將打靶載體導入水稻細胞的方法，包括下述步驟：

(1)將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織；

(2)將次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基預培養；

(3)將步驟(2)中獲得的愈傷組織與攜帶PL-LbCpf1-RR的打靶載體 (pHUN 6a11-PDS)的農桿菌接觸15分鐘；