[發(fā)明專利]一種CYP2C19*2基因型檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710498272.2
• 申請日: 2017-06-27
• 公開（公告）號: CN107164521A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫茜
• 申請（專利權(quán)）人: 踏石生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司32103
• 代理人: 馬明渡,楊超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種CYP2C19*2基因型檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒采用PCR體外擴(kuò)增法，用于定性檢測人全血樣本中藥物代謝酶CYP2C19*2位點(diǎn)第681位點(diǎn)的變異。

背景技術(shù)

細(xì)胞色素P450（CytochromeP45，簡稱CYP）同功酶也稱藥酶，是由一系列結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的酶組成的超家族，是體內(nèi)藥物代謝的主要酶系。其中CYP2C19酶具有遺傳多態(tài)性，酶活性在不同個(gè)體間存在顯著差異。根據(jù)患者基因型的不同，通過CYP2C19酶代謝的藥物的療效和副作用也有明顯差異。CYP2C19參與氯吡格雷、S-美芬妥英、奧美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等藥物的代謝。CYP2C19遺傳變異可導(dǎo)致酶活性的個(gè)體差異，使人群出現(xiàn)超快代謝者（ultrarapid metabolizer，UM）、快代謝者（extensive metabolizer，EM）、中間代謝者（intermediate metabolizer，IM）和慢代謝者（poor metabolizer，PM）4種表型。CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）和CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）是中國人群中存在的2種導(dǎo)致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。CYP2C19*2導(dǎo)致剪接缺失，CYP2C19*3為終止密碼子突變。EM個(gè)體只攜帶CYP2C19*1等位基因，IM個(gè)體攜帶CYP2C19*2或CYP2C19*3雜合子基因型；PM個(gè)體包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。東方人群中75~85％ 的PM由CYP2C19*2所致，約20~25％ 的PM由CYP2C19*3所致。對于通過CYP2C19基因產(chǎn)物進(jìn)行代謝的治療藥物，CYP2C19的基因型信息可以判斷患者對此類藥物的代謝速率。

目前臨床或?qū)嶒?yàn)室檢測CYP2C19基因型的方法包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、熒光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法、原位雜交（ISH）等多種方法。

PCR-直接測序法也稱PCR-Sanger測序。PCR-Sanger測序法的操作過程主要包括PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物純化、測序反應(yīng)、測序和結(jié)果分析四個(gè)主要步驟。該方法屬于定性檢測。主要不足：靈敏度不高，尤其是在進(jìn)行腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測時(shí)，當(dāng)組織中靶標(biāo)基因突變比例低于20％時(shí)，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果；對試劑和儀器有特殊要求，不易普及；操作復(fù)雜，成本相對較高，速度慢、通量低。

PCR-焦磷酸測序法需設(shè)計(jì)一條生物素標(biāo)記的測序引物，當(dāng)引物與單鏈模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。主要缺點(diǎn)：對試劑和儀器有特殊要求，不易普及；檢測靈敏度有限，對腫瘤組織中的低豐度體細(xì)胞突變（<3％）容易出現(xiàn)假陰性；測序長度僅10多個(gè)堿基，不能對長片段進(jìn)行分析。

實(shí)時(shí)熒光PCR法可分為探針法和非探針法兩種，前者利用與靶序列特異雜交的探針（Taqman和分子信標(biāo)）來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，后者利用熒光染料或特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度高，分型準(zhǔn)確，操作簡便快捷，所用儀器容易普及，易于推廣使用。但該方法通量不高，探針成本較高，單個(gè)位點(diǎn)的檢測成本與樣本量有關(guān)，樣本量越小，成本越高。

PCR-基因芯片法以特定的寡核苷酸片段作為探針，將其有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后將樣品DNA通過PCR擴(kuò)增、熒光標(biāo)記等程序，按堿基配對原理與芯片雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片上的熒光信號進(jìn)行檢測和分析，從而迅速獲得個(gè)體的基因型信息。該方法用于DNA基因分型時(shí)屬于定性檢測，靈敏度為50 ng/μL。

PCR-電泳分析是指對待分析的目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小對基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。該方法屬于定性檢測，且只能用于對已知的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，不能識別未知多態(tài)性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種CYP2C19*2基因型檢測試劑盒及其檢測方法，利用該試劑盒能夠快速、簡便地檢測CYP2C19基因上CYP2C19*2位點(diǎn)的變異和類型。