[發明專利]一種化學發光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法

在審

• 申請號: 201710496313.4
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107219216A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 齊寧利;楊春亮;龔霄;葉劍芝
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙)44387
• 代理人: 顏春艷

技術領域

本發明涉及醫學免疫體外診斷領域，更具體地說，涉及一種化學發光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法。

背景技術

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1簡寫為AFB1)是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)。黃曲霉毒素B1是已知的化學物質中致癌性最強的一種。黃曲霉毒素B1對包括人和若干動物具有強烈的毒性，其毒性作用主要是對肝臟的損害。

在天然食物中以黃曲霉毒素B1最為多見，危害性也最強，國家質檢總局規定黃曲霉毒素B1是大部分食品的必檢項目之一；它在WTO確定的重點研究毒物中被列為首位。當食品、飼料制品未能及時曬干或儲藏不當時極易受到黃曲霉毒素B1污染，黃曲霉毒素B1可通過直接或間接進入人類食物鏈，在機體內干擾信息RNA和DNA的合成，進而影響細胞蛋白質的合成，導致機體全身性的損害，其主要靶器官是肝臟，嚴重時可引起肝硬化、肝癌甚至死亡。并且，黃曲霉毒素B1十分耐熱，分解溫度為268℃，故在烹調過程中很難將其破壞。因此，把好食物及飼料入口關，建立簡便、快速、靈敏的黃曲霉毒素B1檢測方法顯得至關重要。

國內早期檢測黃曲霉毒素常用的方法有薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)，但二者均存在著檢測時間長、儀器設備昂貴、操作復雜且不適于大批量樣品的檢測、需專業人員進行操作等缺點。免疫化學分析法的應用開辟了黃曲霉毒素B1檢測的新領域，目前常用的方法有放射免疫分析法、熒光免疫分析法和酶聯免疫分析法等。其中，放射免疫分析雖然高靈敏、高特異，但存在有效期短、具有放射性污染的缺點；熒光免疫分析法雖然特異性強、敏感性高、速度快，但非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，程序也比較復雜；酶聯免疫分析法是70年代出現的新的免疫測定技術，其原理是抗原(或抗體)吸附于載體上的免疫吸附劑和用酶標記的抗體(或抗原)與標本中的待測物(抗原或抗體)起特異的免疫學反應，然后加入酶底物進行顯色反應，通過顏色的深淺來判斷樣品中待測物的含量，雖然靈敏度高、特異性強，但存在內源性酶干擾、終止液為具有腐蝕性的硫酸、底物大部分有毒或為致癌物質、吸光度的檢測易受到劃痕等多種外在因素的影響等缺點。

化學發光免疫分析法是在抗原抗體特異性結合的基礎上，依據化學發光檢測體系中待測物濃度與體系的化學發光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發光強度進行檢測，從而確定待測物含量的一種痕量分析方法。吖啶酯是一類良好的熒光試劑，發光效率高，光猝滅效應小，反應條件溫和，不受連接臂長短的影響，近年來受到免疫化學工作者的廣泛關注。吖啶酯可以通過標記抗原、抗體和DNA等生物大分子，實現化學發光免疫分析。化學發光免疫分析法因靈敏度高、線性動力學范圍寬、光信號持續時間長、分析方法簡便快捷、結果穩定、誤差小、安全性好及使用期長等優點，近年來在食品、臨床、獸醫、生命科學、環境等領域起到重要作用，是快速檢測食品、飼料中微量毒素殘留的重要手段。

黃曲霉毒素具有很強的毒性和致癌性。黃曲霉毒素是微生物產生的，不像三聚氰胺屬于惡意添加。黃曲霉毒素是脂溶性的，如果牛飼料中存在黃曲霉毒素，牛肉中含量不會很高。但內臟特別是肝臟中含量會高。黃曲霉毒素非常耐熱，加熱到280°都不會被破壞，所以米粉中只要含有，就不會被去除。紫外線只能少量破壞。從而，這導致在米粉中可能會含有黃曲霉毒素，由于嬰兒在成長時期，幾乎都會選擇一定量的米粉喂養，這便需要對嬰兒米粉(或者其他食品)進行黃曲霉毒素B1的檢測，根據《GB 10765-2010食品安全國家標準嬰兒配方食品》中規定：黃曲霉毒素M1或黃曲霉毒素B1≤0.5μg/kg。

目前，雖然針對黃曲霉毒素B1的檢測方法及檢測試劑盒的產品也有不少，但這些檢測產品檢出限較高，應用于常規的檢測，對于嬰兒食品中的黃曲霉毒素B1的檢測，難以達到效果，即使有一些較為精密的檢測產品，但檢測成本高，一般的，因此，需要提供一種方便快速同時檢出限相對較低(滿足嬰兒食品中的黃曲霉毒素B1的檢測)的方法。

發明內容

為了解決上述現有技術存在的缺陷，本發明提供了一種更加快速、靈敏的AFB1含量檢測方法。

本發明的技術方案為：一種化學發光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理：

將嬰兒米粉與水按照5％稀釋為樣品液，37℃保濕封閉，備用；

(2)制備黃曲霉毒素B1抗原AFB1-BSA：