[發(fā)明專利]一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710496313.4
• 申請日: 2017-06-26
• 公開（公告）號: CN107219216A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 齊寧利;楊春亮;龔霄;葉劍芝
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 佛山幫專知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)44387
• 代理人: 顏春艷

1.一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)樣品前處理：

將嬰兒米粉與水按照5％稀釋為樣品液，37℃保濕封閉，備用；

(2)制備黃曲霉毒素B1抗原AFB1-BSA；

(3)制備吖啶酯標記的黃曲霉毒素抗原AFB1-BSA-AE：

(4)建立標準曲線；

(5)加樣進行免疫反應測定；

(6)讀值定量：

根據(jù)檢測的結果對比標準曲線獲得黃曲霉毒素B1的含量。

2.如權利要求1中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步驟(2)中，用黃曲霉毒素B1與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中反應生成黃曲霉毒素B1肟，再用活性酯法將黃曲霉毒素B1肟與載體蛋白偶聯(lián)合成完全抗原。

3.如權利要求1中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步驟(3)中包括：稱取吖啶酯酸1mg溶解于200ul N,N-二甲基甲酰胺中，取該溶液50μL緩慢滴入250μL 3.5mg/mL的AFB1-BSA溶液中，并加入40μL 0.1mol/L PBS，于25℃避光、150r/min反應過夜，反應結束后，用蒸餾水4℃透析2d，備用。

4.如權利要求1中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步驟(4)中，包括步驟：用二抗包被2條化學發(fā)光板，37℃溫育2h；洗板3次，每孔加入350μL蒸餾水，37℃保濕封閉1.5h；洗板3次，每孔加入等量AFB1單克隆抗體，37℃溫育45min；加入濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/mL的AFB1標準品各50μL和經(jīng)稀釋的AFB1-BSA-AE各50μL，混勻，空白孔加入100μL PBS，37℃恒溫45min；洗板，每孔加入吖啶酯啟動劑100μL，然后通過化學發(fā)光儀加入啟動劑100μL，邊加邊測；計算各濃度的結合率，制作標準曲線。

5.如權利要求4中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：制作標準曲線時，結合率(％)＝B/B0×100％，其中B0為不加AFB1的發(fā)光值，B為加AFB1的發(fā)光值。

6.如權利要求4中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：制作標準曲線時，每孔按照1∶1800加入AFB1單克隆抗體100μL。

7.如權利要求4中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：制作標準曲線時，按照1∶500稀釋AFB1-BSA-AE。

8.如權利要求1中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步驟(5)中，用二抗進行包被，37℃溫育2h；洗板，每孔加入350μL樣品液，37℃保濕封閉1.5h；洗板，加入AFB1單克隆抗體4μg/mL進行競爭性化學發(fā)光檢測。

9.如權利要求4或8中所述化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于：采用15μg/mL兔抗鼠IgG二抗進行包被。