[發明專利]一種促進紅系分化的新分子USP12及其應用

在審

• 申請號: 201710488329.0
• 申請日: 2017-06-23
• 公開（公告）號: CN107460172A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 劉靜;彭元亮;梁龍;朱澤森;蕭小鵑;陳慧勇
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所11039
• 代理人: 劉江良

技術領域

本發明屬于生物醫學與臨床醫學技術領域，涉及一個與紅系分化相關的關鍵新分子—USP12(又名UBH1、USP12L1)。并建立了基于USP12的用于增強誘導慢性粒細胞白血病細胞K562細胞分化及其檢測方法。

背景技術

USP12是一種半胱氨酸水解酶型去泛素化酶，是USPs/UBPs家族成員之一，與USP46高度同源。位于人類染色體13q12.13的27066142-27171896序列，共含105755個堿基，該基因所編碼蛋白包含370個氨基酸，分子質量為42858Da，是一種具有USP結構域的去泛素化酶，其序列為：MEILMTVSKFASICTMGANASALEKEIGPEQFPVNEHYFGLVNFGNTCYCNSVLQALYFCRPFREKVLAYKSQPRKKESLLTCLADLFHSIATQKKKVGVIPPKKFITRLRKENELFDNYMQQDAHEFLNYLLNTIADILQEERKQEKQNGRLPNGNIDNENNNSTPDPTWVHEIFQGTLTNETRCLTCETISSKDEDFLDLSVDVEQNTSITHCLRGFSNTETLCSEYKYYCEECRSKQEAHKRMKVKKLPMILALHLKRFKYMDQLHRYTKLSYRVVFPLELRLFNTSGDATNPDRMYDLVAVVVHCGSGPNRGHYIAIVKSHDFWLLFDDDIVEKIDAQAIEEFYGLTSDISKNSESGYILFYQSRD

目前有研究發現USP12需要與輔因子Uaf-1和WDR20形成USP12/Uaf-1/WDR20催化復合物才具有酶促活性。USP12能通過其作用底物調控NFκB，NFAT，MAPK，Notch，Akt等多條信號通路，參與T細胞受體(T cell receptor，TCR)和雄激素受體(androgen receptor，AR)的穩定，也能通過其作用底物調控淋巴母細胞和Hela細胞增殖。另外，在非洲爪蟾(Xenopus)中USP12也能是組蛋白H2A和H2B去泛素化。調控原腸胚期的中胚層發育相關基因的表達，進而影響非洲爪蟾原腸胚的進一步發育。

USP12在造血發育特別是紅系發育過程中的研究目前還未見報道。我們首次研究發現USP12在紅系發育過程中的表達逐步升高，USP12的過表達能顯著促進Hemin誘導的K562細胞向紅系分化，而使用siRNA敲低USP12的表達則能顯著抑制Hemin誘導的K562細胞向紅系分化。基于以上研究成果，表明USP12是一種促紅系分化的關鍵新分子，基于USP12可設計用于慢性粒細胞性白血病診斷和分化治療的新策略。

發明內容

本發明是針對紅系發育調控復雜而精準，紅系發育調控紊亂會導致慢性粒細胞性白血病等疾病的發生而做出的。本發明提供了一種促紅系分化的關鍵新分子——USP12對hemin誘導慢性粒細胞性白血病細胞K562細胞向紅系分化方法。該分子的發現將推動慢性粒細胞性白血病的診斷和治療。

本發明提供的技術方案是：一種促K562細胞向紅系分化的方法，該方法是在所述的細胞中過表達USP12。

進一步地，上述的方法，在所述的細胞中過表達USP12后，然后聯合Hemin誘導所述細胞能更有效的促進其向紅系分化。

在上述的方法中，用聯苯胺染色、qRT-PCR和Western blot檢測細胞血紅蛋白表達情況；所述qRT-PCR使用引物如下：

其中GAPDH用作內對照。

所述qRT-PCR反應體系如下：

所述qRT-PCR反應程序如下：

本發明還提供一種用于誘導慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞分化的試劑盒，其包括的引物的序列如下：

USP12重組引物正向：

GATAAGAGCCCGGGCGGATCCATGGAAATCCTAATGACAGTCTC

USP12重組引物反向：

GTCGACGGTATCGATCCCAAGCTTTCAGTCCCGAGACTGATAGA

USP12qPCR引物正向：CCACCAATCCAGACAGAATGTA

USP12qPCR引物反向：GTCGTCATCAAACAACAACCAA

其中USP12重組引物用于構建USP12過表達載體，USP12qPCR引物用于檢測USP12的表達，其在紅系發育過程中的表達逐步上調。