[發明專利]一種胰島素類似物及其合成方法

在審

• 申請號: 201710484866.8
• 申請日: 2017-06-23
• 公開（公告）號: CN107141350A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 田長麟;張隆華;黃棟梁;郭曉奇;周莉
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學先進技術研究院
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 合肥市上嘉專利代理事務所(普通合伙)34125
• 代理人: 姜玲燕

技術領域

本發明涉及蛋白質多肽領域，具體地說涉及一種胰島素類似物及其合成方法。

背景技術

胰島素是由胰臟內的胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。

胰島素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發現。顯微鏡下的胰島β細胞顯微鏡下的胰島β細胞。1922年開始用于臨床，使過去不治的糖尿病患者得到挽救。中國科學院腎病檢測研究所主治直至80年代初，用于臨床的胰島素幾乎都是從豬、牛胰臟中提取的，這就是第一代胰島素-動物胰島素。不同動物的胰島素組成均有所差異，豬的與人的胰島素結構最為相似，只有B鏈羧基端的一個氨基酸不同。動物胰島素是最早應用于糖尿病治療的胰島素注射制劑一般是豬胰島素，豬胰島素與人胰島素存在1至4個氨基酸的不同，因此容易發生免疫反應，注射部位皮下脂肪萎縮或增生，胰島素過敏反應，并且由于其免疫原性高，容易反復發生高血糖和低血糖，容易出現胰島素抵抗。

80年代初已成功地運用遺傳工程技術由微生物大量生產人的胰島素，并已用于臨床，這就是第二代胰島素-人胰島素。雖然人胰島素相比于動物胰島素有很多優點，但是，在起效時間、峰值時間、作用持續時間上不能模擬生理性人胰島素分泌模式。需在餐前30分鐘注射、有較高的夜間低血糖風險。

20世紀90年代末，在對人胰島素結構和成分的深入研究中發現，對肽鏈進行修飾：利用基因工程技術，改變胰島素肽鏈上某些部位的氨基酸組合；改變等電點；增加六聚體強度；以鈷離子替代鋅離子；在分子中增加脂肪酸鏈，加大與白蛋白的結合，均有可能改變其理化和生物學特征，從而可研制出更適合人體生理需要的胰島素類似物(insulinsimilitude)，也就是第三代胰島素。胰島素類似物可緊臨餐使用，也稱為餐時胰島素或速效胰島素。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種穩定性高的胰島素類似物。

為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：一種胰島素類似物，其A鏈和B鏈序列及結構如下：

本發明還提供上述胰島素類似物的合成方法，包括以下步驟：

采用Fmoc固相合成法，以樹脂作為固相載體，經縮合劑活化，按照權利要求1所示的序列分別將A鏈和B鏈氨基酸由C端向N端逐個偶聯到樹脂上，且其中A鏈第11位Cys由式1所示的二氨基二酸構件單元所替換，待A鏈第11位二氨基二酸構件單元耦合完后，由C端向N端繼續耦合直至A鏈第7位，待A鏈第7位耦合完后，先脫除Alloc保護基團和Fmoc保護基團，再令A鏈第11位二氨基二酸構件單元與A鏈第7位氨基酸進行縮合成環，最后繼續耦合A鏈第5位以及余下的氨基酸；

最后經切割液處理以及連接后，獲得所述胰島素類似物；

進一步地，合成A鏈所用的樹脂為Rink AM amide resin，合成B鏈所用的樹脂為2-Cl-Trt-Cl-resin。

進一步地，所述縮合劑選自HATU、HOAT、PyAOP中的任意一種或任意幾種。

進一步地，合成溫度為25℃。

進一步地，A鏈第21位氨基酸為Fmoc-Asp-O^tBu、第7位氨基酸為Fmoc-Cys(Acm)-OH；B鏈第7位氨基酸為Fmoc-Cys(Acm)-OH。

進一步地，Alloc保護基團的脫除試劑為四(三苯基膦)鈀與苯硅烷的混合物。

進一步地，Fmoc保護基團的脫除試劑為含有20vt％哌啶的DMF溶液。

進一步地，A鏈所用的切割液為三氟乙酸、苯酚、水、茴香硫醚、乙二硫醇的混合液；B鏈所用的切割液為三氟乙酸、水、TIPS、DTNP的混合液。

本發明的有益效果體現在：

本發明胰島素類似物具有非常穩定的結構，通過在肽片段的合成中引入S-C鍵替換容易斷裂S-S鍵，不僅可以起到穩固蛋白空間構象的作用，也可以促進復性過程的剩余二硫鍵的配對提高整體復性效率。另外本發明方法操作簡便，收率高，獲得的胰島素類似物具有更好的穩定性。

附圖說明

圖1是本發明胰島素類似物的A鏈HPLC色譜圖。

圖2是本發明胰島素類似物的B鏈HPLC色譜圖。

圖3是本發明胰島素類似物的A鏈和B鏈兩步連接反應HPLC色譜圖。