[發(fā)明專利]一種一步逆轉(zhuǎn)錄RT?qPCR人MTHFR與MTRR基因多態(tài)性表達(dá)的檢測試劑盒

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• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN107236801A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林家旺;張秋芳;崔勤;何幸
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門金諾威生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，是一種體外診斷試劑，具體是指一種一步逆轉(zhuǎn)錄RT-qPCR人MTHFR與MTRR基因多態(tài)性表達(dá)的檢測試劑盒。

背景技術(shù)

亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是甲硫氨酸-葉酸代謝系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，與甲硫氨酸合成酶還原酶(Methionine synthase reductase，MTRR)一起，維持葉酸正常代謝。另外，MTHFR還參與維持體內(nèi)正常的同型半胱氨酸水平。

體內(nèi)MTHFR和MTRR基因突變可導(dǎo)致其編碼的葉酸代謝關(guān)鍵酶活性降低，引起葉酸代謝障礙，造成葉酸水平降低及高同型半胱氨酸血癥(HCY)。

對于MTHFR和MTRR基因異常的人，MTHFR和MTRR酶活性明顯降低，造成葉酸代謝障礙，導(dǎo)致新生兒神經(jīng)管缺陷、唐氏綜合癥及唇腭裂等疾病的發(fā)病風(fēng)險明顯增高，這類人需要補(bǔ)充更多的葉酸，以及用更長的周期補(bǔ)充葉酸才能達(dá)到預(yù)期的效果。

此外，MTHFR和MTRR基因異常易出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥(HCY)，早期進(jìn)行基因檢測有利于預(yù)防高同型半胱氨酸血癥(HCY)及心腦血管疾病。

因此，及時、準(zhǔn)確地檢測到人體MTHFR和MTRR基因異常對于指導(dǎo)備孕婦女如何有效補(bǔ)充葉酸，防止胎兒畸形，以及在人類預(yù)防HCY、心腦血管疾病等方面具有至關(guān)重要的意義。

目前，人體MTHFR與MTRR基因多態(tài)性和多態(tài)性表達(dá)的檢測具有以下幾種方法：1.DNA直接測序法；2.DNA-PCR-SSCP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)；3.DNA-高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(HRM)；4.DNA-反向點(diǎn)雜交法；5.DNA-實(shí)時熒光PCR法；6.RNA-實(shí)時熒光PCR法。

1.DNA直接測序法

DNA直接測序法是進(jìn)行葉酸代謝基因突變檢測最直接最準(zhǔn)確的方法，是檢測未知的地貧突變基因的關(guān)鍵方法。但其需要對樣品進(jìn)行擴(kuò)增、純化、序列分析，所需的時間長，成本高，對取材和技術(shù)的要求都比較高，最重要的是限制靈敏度不高，對環(huán)境和操作者有危害。因此在臨床應(yīng)用上具有一定的限制。

2.DNA-PCR-SSCP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)

PCR-SSCP是一種比較經(jīng)典的基因突變檢測方法，是一種定性檢測基因突變的方法，可以對未知的突變進(jìn)行檢測。具有快速、簡便、靈敏和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，受到廣大研究者的青睞。但其也有一定的缺陷，電泳時間較長，操作步驟繁瑣，只能進(jìn)行定性分析，需要平行的標(biāo)準(zhǔn)對照。

3.DNA-高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(HRM)

利用不同長度或不同堿基組成的DNA序列熔解曲線不同，在PCR后直接運(yùn)行高分辨熔解進(jìn)行樣品突變分析，能夠區(qū)分不同突變位點(diǎn)與不同基因型，但是HRM對儀器要求較高，受到儀器使用的限制。

4.DNA-反向點(diǎn)雜交法

反向點(diǎn)雜交法(RDB)是目前國內(nèi)外最常用的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于一張雜交膜上可同時篩查多種點(diǎn)突變或者基因型，它的缺點(diǎn)也很明顯，由于需要開蓋進(jìn)行后續(xù)處理，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)時間長，實(shí)驗(yàn)室也很容易受到氣溶膠的污染。

5.DNA-實(shí)時熒光PCR法

實(shí)時熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)的PCR基礎(chǔ)上加入了熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)定量或定性的功能。它擺脫了凝膠電泳技術(shù)，避免了有毒操作，操作簡便。實(shí)時熒光PCR檢測葉酸代謝基因突變，不需要檢基因組DNA的具體含量，僅需檢測樣本是否具有信號即可，這使得整個過程更加簡便，費(fèi)用更低，而且PCR反應(yīng)具有核酸擴(kuò)增的高效性，即使只有微量的基因也可以檢測出來，從而使它具有很高的靈敏度。

目前多數(shù)人MTHFR與MTRR基因多態(tài)性檢測試劑采用實(shí)時熒光PCR法進(jìn)行檢測，具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。但是DNA-實(shí)時熒光PCR法針對的是MTHFR與MTRR的DNA序列，而不是針對發(fā)揮功能的RNA，并且DNA的合成產(chǎn)物不僅僅包括翻譯區(qū)的外顯子，還包括非編碼區(qū)的內(nèi)含子序列，因此該方法缺少檢測的特異性。

6.RNA-實(shí)時熒光PCR法

RNA-實(shí)時熒光PCR法是針對RNA進(jìn)行檢測，目前針對基因組表達(dá)RNA的檢測需要通過逆轉(zhuǎn)錄將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后對cDNA進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測。該操作方法繁瑣，需要兩步反應(yīng)，同時需要對cDNA進(jìn)行稀釋后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，稀釋過程容易產(chǎn)生氣溶膠，造成實(shí)驗(yàn)室的大面積污染。

發(fā)明內(nèi)容