[發明專利]應用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法

有效

• 申請號: 201710453876.5
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107102091B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 惠伯棣;王旭;宮平;胡春鳳;徐志文
• 申請（專利權）人: 秦皇島惠恩生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/74;G01N30/86
• 代理公司: 北京中企鴻陽知識產權代理事務所(普通合伙) 11487
• 代理人: 郭鴻雁

本發明應用Asta?E?H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，涉及一種天然植物中有效成分含量測定的方法。其目的是為了提供應用Asta?E?H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，該方法采用脂肪酶催化水解經吐溫80乳化后的雨生紅球藻萃取物中的蝦青素酯，然后采用高效液相色譜法對其中的蝦青素進行測定。本發明的方法包括以下步驟：蝦青素標準液的配制；磷酸鹽緩沖液的配制；雨生紅球藻萃取物樣品液的制備；高效液相色譜法測定蝦青素含量。本發明的方法酶解過程中不產生蝦紅素副產物及順式游離態蝦青素，檢出限低，加樣回收率高，線性關系良好，且成本低廉，易于推廣應用。

技術領域

本發明涉及一種天然植物中有效成分含量測定的方法，特別是涉及一種借助于測定材料的化學或物理性質來測試或分析材料的方法。

背景技術

在人體內，蝦青素可發揮多種健康功能，如：抗氧化、光保護、抗癌、增強免疫、維護眼睛健康和維護中樞神經系統健康等。因此，在保健食品、功能性食品添加劑、普通食品和飼料中具有廣闊的應用前景。

雨生紅球藻是目前已知的自然界中蝦青素積累水平最高的生物資源，是天然蝦青素的主要來源。雨生紅球藻中的蝦青素主要以蝦青素酯的形式存在，其中，單酯占多數。

目前，雨生紅球藻已經在我國被批準為新食品原料，在食品中合法使用。其中蝦青素的含量成為以蝦青素為功效因子或標志性成分的保健食品和食品添加劑產品的主要質量控制指標。因此，雨生紅球藻及其萃取物和產品中蝦青素含量的測定方法被越來越多地關注。目前，已報導的檢測方法有四類：(1)國標GBT 31520-2015中記載的方法。在檢測雨生紅球藻及萃取物中蝦青素的含量時，首先將蝦青素酯皂化，使蝦青素酯水解成游離態的蝦青素，而后采用外標法在C30-HPLC上進行定量。該方法存在的問題是皂化可能產生副產物—蝦紅素，同時由于蝦青素的生物活性，在堿皂化過程中損失量極大，對檢測結果產生影響。(2)另一類方法是將蝦青素酯酶促水解成游離態的蝦青素，而后再采用外標法在C30-HPLC上進行定量。該方法中使用的水解酶為膽固醇酯水解酶。該方法源于美國藥典，日本的富士化學株式會社、青島森淼生物技術有限公司、云南愛爾發蝦青素生物技術有限公司等企業的企業標準中均采用此方法。但是膽固醇酯酶是一種針對于膽固醇酯的水解酶，對蝦青素的專一性較差，檢測過程中重復性較差，在反應中易產生順式游離態蝦青素，影響檢測結果，且膽固醇酯水解酶的價格較高，不易推廣。(3)第三類方法是不經過水解，以UV-VIS法為基礎，測定萃取物中總類胡蘿卜素的吸光值，推斷其中游離態蝦青素的含量，詳見惠伯棣等人的報導，該方法檢出限太高，線性關系較差，且對分析人員的要求極高，一般人員很難做到詳細分析。(4) 此外，還有一些方法專注于光學異構體的檢測，更難于應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種應用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，該方法采用源于畢赤酵母突變株的新型脂肪酶Asta-E-H為水解用酶，催化水解雨生紅球藻萃取物中的蝦青素酯，將蝦青素酯乳化后，溶解于磷酸鹽緩沖體系中，并將脂肪酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，在特定的反應條件下，完成蝦青素酯的水解，然后將水解產物用正己烷萃取后，再采用高效液相色譜法對其中的蝦青素進行測定。

本發明涉及一種應用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)蝦青素標準液的配制：稱取0.95～1.05mg(精確至0.00001g)蝦青素標準品，記為 M_B，用丙酮定容至10mL，取1mL用丙酮定容至5mL；蝦青素標準液的濃度為C_Ast：