[發(fā)明專利]應(yīng)用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710453876.5
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107102091B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 惠伯棣;王旭;宮平;胡春鳳;徐志文
• 申請（專利權(quán)）人: 秦皇島惠恩生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/74;G01N30/86
• 代理公司: 北京中企鴻陽知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11487
• 代理人: 郭鴻雁

1.一種應(yīng)用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

(1)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取0.95～1.05mg蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，記為M_B，用丙酮定容至10mL，取1mL用丙酮定容至5mL；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為C_Ast：

(2)磷酸鹽緩沖液的配制：11.411g磷酸氫二鉀溶解于500mL水中，得到0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液；6.8045g磷酸二氫鉀溶解于500mL水中得到0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液；將61.5mL的0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液與38.5mL的0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液混合，得到0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值為7；

(3)雨生紅球藻萃取物樣品液的制備：

a、雨生紅球藻供試液的配制：研缽中加入45～55mg吐溫80，再加入45～55mg雨生紅球藻萃取物，記為M_S，研磨乳化混勻后，加入3～5mL磷酸鹽緩沖液溶解，之后用磷酸鹽緩沖液定容至10mL，制得雨生紅球藻供試液；

b、雨生紅球藻萃取物的酶促水解：稱取1g脂肪酶Asta-E-H粉劑，加入2～3mL磷酸鹽緩沖液混勻，然后加入0.1mL步驟a中制得的雨生紅球藻供試液，之后用磷酸鹽緩沖液定容至5mL，31℃水浴5h，得到反應(yīng)液；

c、反應(yīng)液的前處理：取0.4mL步驟b制得的反應(yīng)液，加入0.8mL蒸餾水混勻，加入1mL丙酮混勻，再加入1mL丙酮混勻，加入0.8mL正己烷混勻，靜置30s后3000r/min離心5min；離心后的混合溶液分層，用移液槍移出上相液體，再重復(fù)用0.8mL正己烷萃取下相，靜置離心，移出上相的操作，直至上相液體無色；合并上相萃取液，用氮氣濃縮，最終吹干在1.5mL的離心管中；

d、雨生紅球藻萃取物樣品液：向步驟c的離心管中加入0.1mL丙酮，超聲30s后10000r/min離心5min，得到用于高效液相色譜法分析的雨生紅球藻萃取物樣品液S；

(4)采用高效液相色譜法測定步驟(1)配制的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液峰面積P_B及步驟(3)制得的雨生紅球藻萃取物樣品液的峰面積P_S，根據(jù)所得峰面積和蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液的濃度計算雨生紅球藻萃取物中蝦青素的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，其特征在于：所述步驟(3)中Asta-E-H脂肪酶粉劑的酶活為30000U/g～50000U/g。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，其特征在于：所述步驟(4)中高效液相色譜條件為：采用的色譜柱為YMC-CarotenoidS54.6*250m；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：20μL；檢測波長：470nm；柱溫：25℃；

所述步驟(4)中高效液相色譜條件中流動相采用的梯度洗脫程序為：

0min時，流動相A：流動相B＝83:17；

15min時，流動相A：流動相B＝68:32；

23min時，流動相A：流動相B＝18:82；

27min時，流動相A：流動相B＝83:17；

35min時，流動相A：流動相B＝83:17；

上述流動相A為甲醇，流動相B為甲基叔丁基醚，上述比例為體積比。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項權(quán)利要求中所述的應(yīng)用Asta-E-H脂肪酶定量檢測雨生紅球藻萃取物中蝦青素的方法，其特征在于：所述雨生紅球藻萃取物中蝦青素的含量按下式進(jìn)行計算：

式中：

X：雨生紅球藻萃取物中蝦青素的含量，％；

C_Ast：蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液濃度，mg/mL；

P_S：雨生紅球藻萃取物樣品液的峰面積，mAU·S；

P_B：蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液峰面積，mAU·S；

M_S：雨生紅球藻萃取物質(zhì)量，mg。