[發明專利]基于甲病毒復制子雞球蟲的DNA疫苗及制備方法

在審

• 申請號: 201710442590.7
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107460205A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 李建華;祝濤;張西臣;朱剛;宮鵬濤;杜義明;楊舉
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K39/012;A61P33/02
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明提供了一種基于甲病毒復制子雞球蟲的DNA疫苗，為一種新型的雞球蟲DNA疫苗，可用于雞球蟲病的預防，屬于基因工程技術領域。

背景技術

雞球蟲病是由艾美耳屬的球蟲寄生于雞腸道引起的一種寄生性原蟲病，尤以柔嫩艾美耳球蟲的致病力最強，故成為本病防治的重點。由于該病嚴重影響雞體的生長發育、產蛋率等，給對養雞業的危害巨大，據相關統計每年給全世界造成的經濟損失達30多億美元。然而，目前防治該病主要依靠藥物和活球蟲疫苗，但長期使用藥物防治球蟲會導致耐藥蟲株以及藥物殘留等問題，且活疫苗存在散毒、毒力反祖等問題。故研制出一種免疫效果好、使用安全的疫苗用于預防和控制雞球蟲病是很有必要。

DNA疫苗是目前世界上研究最廣泛的疫苗。它是將某種抗原基因導入真核表達載體中，通過注射的方式注入機體內，并通過宿主的轉錄合成抗原蛋白，從而誘導宿主產生免疫反應，達到預防疾病的目的。低劑量的接種能使機體產生持久的細胞免疫和體液免疫且免疫效果好。DNA疫苗的制備較簡易，易于生產，價格低廉，便于運輸。DNA疫苗相比傳統的疫苗安全性好，本身不會散毒或產生毒素引發其他疾病。盡管DNA疫苗作為新型疫苗，有著許多的優勢，但現在雞球蟲DNA疫苗還處于研究的初級階段，很多技術難關還沒有攻克。人們對DNA疫苗的安全性上還存在一些顧慮，如外源DNA是否能有整合到宿主基因組上的風險，有可能引起基因突變，引發宿主癌變；另外DNA長期低水平的表達外源抗原，會導致自身免疫反應和免疫耐受等，這些問題都制約著DNA疫苗廣泛用于實際。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于甲病毒復制子雞球蟲的DNA疫苗，甲病毒復制子不進入細胞核，僅在胞漿中目的蛋白表達之后便發生凋亡而被機體清理，不會結合到宿主細胞的基因組上，其安全性好。

本發明的技術解決方案如下：

首先獲得柔嫩艾美耳球蟲保護性抗原基因，進行TA克隆，測序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進行酶切反應的pSMARAT2b甲病毒表達載體相連，構建的重組質粒進行菌液PCR和雙酶切鑒定，并進行測序，測序正確的重組質粒轉染293細胞，然后用Western bloting進行分析。

本發明提供的重組質粒，將其命名為pSMARAT2b-Rhomboid3。

本發明以柔嫩艾美耳球蟲保護性抗原Rhomboid3基因為例，進行重組質粒的構建。

、重組質粒pSMARAT2b-Rhomboid3的制備：

首先提取柔嫩艾美耳球蟲的總RNA，提取柔嫩艾美耳球蟲的總RNA并反轉錄為cDNA，通過PCR擴增Rhomboid3基因，然后連接pMD-18T、pSMARAT2b并在DH5α克隆，且通過測序及酶切鑒定，大小為774bp。接著將重組質粒pSMARAT2b-Rhomboid3通過Lipofectamine^TM2000轉入293細胞表達，并對表達產物進行Western blot分析鑒定。

、一種基于甲病毒復制子載體為基礎的雞球蟲DNA疫苗制備方法，其特征在于：

參照Rhomboid3基因DNA序列及甲病毒復制子載體pSMARAT2b物理圖譜設計兩對引物并引入酶切位點：上游引物QF1：5'-CCATCGATAACATTTCACTGGACAAGTCG-3'；其中5`端含有ClaI位點；下游引物QR：5'-TCCCCC GGGACACGTTACTGCGAACCCGCA-3'；5`端含有SmaI位點；將擴增克隆出的目的基因純化后與pMD18-T載體并進行PCR、酶切及測序鑒定，凝膠回收片段與同樣進行酶切的甲病毒復制子載體pSMARAT2b連接，連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞后篩選重組質粒，用SmaI、ClaⅠ進行雙酶切反應，重組質粒命名為pSMARAT2b-Rhomboid3。