[發明專利]一種檢測耳聾基因的引物及其應用

有效

• 申請號: 201710429926.6
• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN107022641B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 王力剛;王景
• 申請（專利權）人: 北京博奧醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種檢測耳聾基因的引物及其應用，具體的涉及SNP位點35delG的改進的高特異性的單堿基延伸引物，本發明同時提供了一種可以同時檢測多個耳聾基因的試劑盒，該試劑盒采用多重PCR擴增引物和單堿基延伸引物，可在同管中同時檢測多個熱點突變，診斷快速、操作簡單、成本低，有助于耳聾致病基因篩查的推廣。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種檢測耳聾基因的引物及其應用。

背景技術

聽覺系統中外耳、中耳、內耳結構異常及聽覺傳導信號通路中的聽神經和各級中樞發生病變，導致聽功能障礙，表現出不同程度的聽力下降，統稱為耳聾。耳聾的致病因素有很多，主要包括環境因素、遺傳因素及環境-遺傳相互作用。30％的遺傳性耳聾除了耳聾外，還伴有其他異常，稱為綜合征型耳聾(SHI)。70％的遺傳性耳聾可單獨發生，稱為非綜合征型耳聾(NSHI)，但是往往伴有前庭功能障礙。

已知遺傳性非綜合征型耳聾有多種遺傳方式，最常見的是常染色體隱性遺傳(AR)，占75％～80％。雖然耳聾致病基因具有較高的基因和位點異質性，但大部分的耳聾是由少數幾個基因的熱點突變引起的，包括GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體基因(mtDNA12SrRNA)等，這使遺傳性耳聾的基因診斷和篩查成為可能。

傳統耳聾基因診斷方法包括限制性片段長度多態性分析(RFLP)、限制性內切酶酶切指紋-單鏈構象多態性分析(REF-SSCP)、變性高效液相色譜法(DHPLC)、實時熒光定量探針法、PCR結合Sanger測序。但是限制性內切酶的識別位點有限，針對特定的基因能檢出的位點很少，導致檢出率低，且反應條件嚴格，操作繁瑣。DHPLC檢測率高，對未知突變的檢測準確率達95％以上，對已知突變大于99％，靈敏度高，但是不能檢測純合突變，且無法得出具體的突變類型和突變位點。實時熒光定量探針則價格昂貴，費時費力，靈敏度低。PCR結合Sanger測序被認為是突變檢測的金標準，但是一般一次只能對一個基因或一個位點進行檢測，導致耳聾患者的檢出率不高。基因芯片是近年來發展起來的一種高通量、自動化的基因檢測方法，讓多基因、多位點同時檢測成為可能，但基因芯片成本昂貴，技術要求高。因此，尋找一種能一次性檢測多個基因熱點突變、可靠、經濟、快速的技術尤為重要。

隨著生物技術的發展，多重PCR的應用使得同時檢測多個突變位點成為可能，而引物的設計就尤為重要。但是采用常規方式進行引物設計時可能面對GC含量高引起錯配的問題，現有技術中主要是采用避開GC含量高區域或者直接使用高GC含量區域的方法進行，但是避開高GC含量區域的方法不能解決某些位點沒有調整的空間，直接使用容易引起引物非特異性結合，干擾檢測。因此尋找一種有效設計引物的方法具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種引物，該引物可以特異性、靈敏的結合靶序列。

本發明的目的之二是提供一種設計引物的方法，使用該方法設計引物能夠降低GC含量，提高引物的結合特異性。

本發明的目的之三是提供一種檢測耳聾基因多態性的試劑盒，使用該試劑盒可以準確、快速、高通量、低成本的實現多個耳聾多態位點的的一次性檢測。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種檢測耳聾基因GJB2點突變的引物，所述突變點為35delG，所述引物包括PCR擴增引物和單堿基延伸引物，其中，PCR擴增引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，單堿基延伸引物序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明提供了一種設計引物的方法，使用A/T堿基替換連續G/C序列中的G/C。

進一步，所述的替換位于連續G/C的第三或第四個位置。在對相應的G/C替換后要保證引物3’端有2～3個堿基與模板鏈互補配對，并且分析替換后的引物擴增分析序列的特異性。