[發(fā)明專利]一種糞腸球菌微膠囊及其制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710429401.2 | 申請日： | 2017-06-08 |
| 公開（公告）號： | CN107260704B | 公開（公告）日： | 2020-02-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王建華;楊新建;滕達(dá);王秀敏;毛若雨;郝婭 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 |
| 主分類號： | A61K9/50 | 分類號： | A61K9/50;A61K47/36;A61K35/744;C12N11/10;C12N11/08;C12N11/04;A23L33/135;A23L33/125;A23P10/30;A23K10/18;A23K20/163;C12R1/46 |
| 代理公司： | 11002 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 100081 北京市海淀區(qū)中關(guān)村*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 球菌 微膠囊 及其 制備 方法 | ||
1.糞腸球菌微膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)糞腸球菌菌懸液的制備；
2)海藻酸鈉-魔芋膠復(fù)合壁材溶液的制備；
3)將1)的菌懸液與2)的壁材溶液混勻，然后加入到含有吐溫80的大豆油中，攪拌至完全乳化；沿盛有上述乳化液的容器壁快速加入CaCl2溶液，攪拌至水油兩相分離，然后離心收集水相中的微膠囊，用CaCl2溶液漂洗收集的微膠囊數(shù)次，然后將微膠囊放置于4℃過夜，最后用無菌紗布濾去多余水分后，制得糞腸球菌微膠囊；
步驟1)配制好的糞腸球菌菌懸液中活菌數(shù)為4.50×1010-10.50×1010cfu/mL；
步驟2)海藻酸鈉-魔芋膠復(fù)合壁材溶液的制備方法如下：向海藻酸鈉的水溶液中加入魔芋膠，加蒸餾水定容至100mL，滅菌后作為復(fù)合壁材溶液備用；所述復(fù)合壁材溶液中海藻酸鈉和魔芋膠的濃度分別為25g/L和2.5g/L；
步驟3)具體為：將1)的菌懸液2mL，與2)的壁材溶液混勻，然后加入到300mL含有0.5w/v％吐溫80的大豆油中，在磁力攪拌器上以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌30min直到完全乳化，然后沿器壁以20mL/s的速度加入100mL 0.1M的CaCl2溶液，低速攪拌至水油兩相分離，最后在350×g條件下離心10min收集水相中的微膠囊，并用0.1M的CaCl2溶液漂洗微膠囊2次，然后將微膠囊放置于4℃過夜；最后用8層無菌紗布濾去多余水分后，制得糞腸球菌微膠囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)配制好的糞腸球菌菌懸液中活菌數(shù)為5.09×1010cfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)糞腸球菌菌懸液的制備方法如下：將糞腸球菌劃線于MRS固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)24h后，挑取單菌落或刮取一環(huán)接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h；然后取上述培養(yǎng)液1mL接種于50mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)10h；培養(yǎng)液在4℃、8500×g條件下離心10min，菌體沉淀用生理鹽水重懸，即得糞腸球菌菌懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的MRS固體培養(yǎng)基是由蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐溫80 1.0mL，CH3COONa·3H2O 5.0g，K2HPO4·7H2O 2.0g，檸檬酸三銨2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，瓊脂15.0g，加蒸餾水溶解，定容至1000mL，pH6.2±0.2，115℃蒸汽滅菌20min，傾倒平板制成；
所述的MRS液體培養(yǎng)基是由蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，硫酸鎂0.1g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸銨2.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸錳0.05g，吐溫80 1.0mL，加蒸餾水溶解，定容至1000mL，pH7.3±0.2，分裝到三角瓶，115℃蒸汽滅菌20min制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述糞腸球菌為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC 1.2024。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述方法制備的糞腸球菌微膠囊。
7.權(quán)利要求6所述糞腸球菌微膠囊在抗模擬胃液和/或模擬腸液環(huán)境中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述糞腸球菌微膠囊加入到模擬胃液和/或模擬腸液的環(huán)境中，26.5-37℃孵育2-4h；
其中，所述模擬胃液為：取濃度為1mol/ml的稀鹽酸，加水稀釋，將pH調(diào)至1.5；每100ml液體中加入1g胃蛋白酶，混勻，用0.22μm的無菌濾頭過濾即得；
所述模擬腸液為：取KH2PO4 6.8g加水500ml溶解，用0.4％的NaOH溶液回調(diào)pH至6.8，每100ml液體中加入1g胰蛋白酶，混勻，用0.22μm的無菌濾頭過濾即得。
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