[發明專利]一種用于檢測絲狀支原體山羊亞種的引物和探針

有效

• 申請號: 201710427626.4
• 申請日: 2017-06-08
• 公開（公告）號: CN107099605B
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 林裕勝;胡奇林;江錦秀;游偉
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供一種用于檢測絲狀支原體山羊亞種的引物和探針，所述引物序列為上游引物：5’?CTAGCTAGCATAGTTGTTG?3’，下游引物：5’?GCTTGAACAACTATATTGTA?3’所述探針序列為：5’?TAACACAGTTAAAGCAGACCCACCA?3’。本發明根據GenBank登錄的FQ377874.1的MLC_1770基因序列，設計特異性引物和探針，于國內外首先建立絲狀支原體山羊亞種的實時熒光定量PCR方法，該方法特異性好、靈敏度高、重復性好，可用于檢測臨床樣品中絲狀支原體山羊亞種的含量。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測絲狀支原體山羊亞種的引物和探針，屬于分子生物學領域。

背景技術

絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mmc)是絲狀支原體簇的成員之一，是羊支原體性肺炎(Mycoplasma pneumonia of goats and sheep, MPGS)的病原之一。MPGS傳染性強，主要通過呼吸道感染，也可垂直傳播，病羊和耐過羊是該病的主要傳染源(賀英等,2009; 萬一元等, 2000)。MPGS的潛伏期平均為18-20d，最快3-6d，最長為30-40d。其臨床特征主要表現為高熱、咳嗽漸進性消瘦以及肺實質、小葉間質及胸膜發生漿液性和纖維素性炎癥，肺部有明顯的肝變為主要特征的呼吸道疾病，此外還可引起乳房炎、角膜結膜炎和敗血病等。該病的發病率為19%-90%，死亡率高達40%。當前國外非洲、西班牙、意大利、美國、約旦，國內四川、貴州、內蒙古、青海、廣西、福建等地均有該病發生的報道。該病給養羊業造成了嚴重的經濟損失，因此，亟需建立一種Mmc特異、敏感、簡便的檢測方法。

國內外關于Mmc的診斷方法研究報道較少，這主要是由于Mmc屬于絲狀支原體簇成員，絲狀支原體簇成員之間同源性較高，血清學上有交叉反應。目前常用的診斷方法主要有支原體分離培養鑒定、PCR等(D’Angelo et al,2010)。前者費時（需要一周以上時間）費力，后者不能定量，且后續鑒定過程繁瑣。熒光PCR是在普通PCR 的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監測的熒光PCR 檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術，具有特異性強、靈敏度高、定量準確、適用性廣等優點。通過查閱文獻發現，當前國內外尚未有針對絲狀支原體山羊亞種檢測的實時熒光定量PCR方法，但該方法已在其他羊病上如羊傳染性膿皰病毒、羊痘病毒和小反芻獸疫上均已有相應的熒光定量PCR檢測方法。本發明的建立可以填補該領域的空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測絲狀支原體山羊亞種的引物和探針。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

用于檢測絲狀支原體山羊亞種的實時熒光定量PCR引物，引物的核苷酸序列為：上游引物：5’- CTAGCTAGCATAGTTGTTG -3’，下游引物：5’- GCTTGAACAACTATATTGTA -3’。

用于檢測絲狀支原體山羊亞種的探針，序列為： 5’-TAACACAGTTAAAGCAGACCCACCA-3’。

所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團（R）和熒光淬滅基團（Q）的寡核苷酸。

利用本發明的引物和探針可用于檢測絲狀支原體山羊亞種的相應基因，尤其適用于基于熒光定量PCR技術的檢測。通過對反應體系和反應條件的優化，建立一種可用于檢測絲狀支原體山羊亞種的熒光定量PCR 方法。

具體操作方法如下：

1、引物設計：根據GenBank上公布的絲狀支原體山羊亞種FQ377874.1基因組序列，利用Primer 6.0 軟件對MLC_1770基因序列進行引物和探針設計，探針合成同時進行兩端熒光標記，探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團為Eclipse，采用BLAST工具進行檢索，初步驗證其特異性。