[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于測(cè)定生物基質(zhì)中硒代蛋氨酸的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710425872.6
• 申請(qǐng)日: 2017-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109030638A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雙慶;俞學(xué)鋒;李知洪;姚鵑;張彥;張海波;彭寧;陳智仙
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安琪酵母股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/14
• 代理公司: 北京格旭知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11443
• 代理人: 雒純丹

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于測(cè)定生物基質(zhì)中硒代蛋氨酸的方法。本發(fā)明提供的用于測(cè)定生物基質(zhì)中硒代蛋氨酸的方法，其包括下述步驟：(1)樣品預(yù)處理：取生物基質(zhì)樣品，加入內(nèi)標(biāo)物甲基硒代半胱氨酸，然后用蛋白質(zhì)沉淀法處理所述生物基質(zhì)樣品，離心得到上清液；(2)含量測(cè)定：采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC?MS/MS)色譜法，將步驟(1)中上清液注入色譜儀，計(jì)算生物基質(zhì)樣品中硒代蛋氨酸的濃度。本發(fā)明的生物基質(zhì)采用蛋白質(zhì)沉淀法，硒代蛋氨酸提取效率高，且生物基質(zhì)對(duì)測(cè)定硒代蛋氨酸無(wú)干擾，采用LC?MS/MS色譜法測(cè)定生物基質(zhì)中的硒代蛋氨酸，速度快、專(zhuān)屬性好、準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于測(cè)定生物基質(zhì)中硒代蛋氨酸的方法。

背景技術(shù)

硒是人和動(dòng)物必需的微量元素，硒僅以硒代蛋氨酸(SeMet)和硒代半胱氨酸兩種形式存在于硒蛋白中，且大部分硒為SeMet。硒通過(guò)硒蛋白影響機(jī)體內(nèi)的自由基代謝、抗氧化功能、免疫功能、生殖功能、細(xì)胞調(diào)亡和內(nèi)分泌激素等而發(fā)揮其生物學(xué)作用，克山病、大骨節(jié)病、糖尿病、艾滋病等40 多種疾病與缺硒有關(guān)。因此，生物體內(nèi)SeMet含量是反應(yīng)體內(nèi)活性硒水平的重要生理指標(biāo)。

全世界有40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)不同程度的缺硒，我國(guó)2/3的地區(qū)屬于缺硒地區(qū)，29.0％的地區(qū)嚴(yán)重缺硒。提高我國(guó)居民的日常硒攝入量，對(duì)于改善國(guó)民健康有重大意義。硒形態(tài)是影響硒的生物利用度和毒性的重要因素。無(wú)機(jī)硒的吸收效果和安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及有機(jī)硒。有機(jī)硒的基本存在形式為硒蛋白，硒僅以SeMet和硒代半胱氨酸兩種形式共價(jià)結(jié)合在蛋白質(zhì)中，SeMet是生物利用度最高的有機(jī)硒化物。因此，測(cè)定動(dòng)物源性食物中SeMet水平對(duì)保證膳食攝入硒量和最佳硒有重要意義。

生物體內(nèi)SeMet水平較低，因此需采用更為靈敏分析方法測(cè)定。目前，測(cè)定SeMet的主要分析方法為高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜法 (HPLC-ICP-MS)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)。但是HPLC-ICP-MS法只能對(duì)Se元素進(jìn)行定量測(cè)定，不能測(cè)定SeMet原形態(tài)，尤其是在機(jī)體內(nèi)存在多種硒形態(tài)時(shí)，需要SeMet標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定，并且一旦有其他硒化合物與SeMet在色譜上有相同的保留時(shí)間時(shí)，則根本無(wú)法鑒定SeMet； GC-MS對(duì)于SeMet等非揮發(fā)性硒化物的檢測(cè)需要進(jìn)行衍生物化處理，存在較多困難；毛細(xì)管電泳法在與ICP-MS聯(lián)用時(shí)，所需流速不同，限制其發(fā)展應(yīng)用。

本發(fā)明所述的硒代蛋氨酸的化學(xué)式為C₁₅H₁₁NO₂Se，分子量為196.1063，結(jié)構(gòu)式為：

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題是：現(xiàn)有技術(shù)中采用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)，但是用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜法 (HPLC-ICP-MS)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，只能對(duì)Se元素進(jìn)行定量限定，不能測(cè)定SeMet 原形態(tài)，尤其是在機(jī)體內(nèi)存在多種硒形態(tài)時(shí)，需要SeMet標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定，并且一旦有其他硒化合物與SeMet在色譜上有相同的保留時(shí)間時(shí)，則根本無(wú)法鑒定SeMet；GC-MS對(duì)于SeMet等非揮發(fā)性硒化物的檢測(cè)需要進(jìn)行衍生物化處理，存在較多困難；毛細(xì)管電泳法在與ICP-MS聯(lián)用時(shí)，所需流速不同，限制其發(fā)展應(yīng)用。

本發(fā)明通過(guò)在生物基質(zhì)樣品中加入內(nèi)標(biāo)物，然后使用蛋白質(zhì)沉淀法對(duì)生物基質(zhì)樣品進(jìn)行處理，然后離心得到上清液，將上清液注入高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜色譜法(LC-MS/MS)，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算生物基質(zhì)樣品中SeMet 的濃度。

具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提出了如下技術(shù)方案。

一種用于測(cè)定生物基質(zhì)中硒代蛋氨酸的方法，其特征在于，其包括下述步驟：

(1)樣品預(yù)處理：取生物基質(zhì)樣品，加入內(nèi)標(biāo)物甲基硒代半胱氨酸，然后用蛋白質(zhì)沉淀法處理所述生物基質(zhì)樣品，離心得到上清液；