[發(fā)明專利]奶牛PAG1檢測試紙條及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710416140.0
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107219368B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 赫小燕;張昱;賀俊平;王海東;曹校瑞;牛姝
• 申請（專利權(quán)）人: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/558
• 代理公司: 太原華弈知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 14108
• 代理人: 李毅

本發(fā)明公開了一種奶牛PAG1檢測試紙條，包括底板，以及粘貼在底板上的上樣墊、膠體金墊、NC膜和吸樣墊，在NC膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述膠體金墊上包被有PAG1單克隆抗體，NC膜的檢測線上包被anti PAG1重組抗原，質(zhì)控線上包被羊抗鼠IgG抗體。本發(fā)明檢測試紙條以anti PAG1重組抗原與PAG1單克隆抗體配對診斷奶牛早期妊娠，具有特異性好、靈敏度高、診斷結(jié)果準(zhǔn)確的特點，能夠快速準(zhǔn)確診斷出奶牛的早期妊娠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種膠體金檢測試劑盒，特別是涉及一種針對牛PAG1抗原的膠體金試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)

反芻動物胎兒胎盤的滋養(yǎng)層雙核細(xì)胞在與母體子宮上皮細(xì)胞融合時，會釋放包括妊娠相關(guān)糖蛋白(Pregnancy-associated glycoprotein，PAG)等物質(zhì)到母畜血液中。這些蛋白質(zhì)對胎盤組織具有特異性，所以可以以母體血液中的PAG含量作為確定妊娠的指標(biāo)。

使用PAG-ELISA法檢測PAG含量，已成為目前國際上比較流行的奶牛早期妊娠診斷方法。但目前這些PAG檢測方法依舊難以在養(yǎng)殖場現(xiàn)場獨立完成。因此，目前養(yǎng)殖業(yè)中尚需要一種準(zhǔn)確、快速且方便的PAG檢測方法用來快速診斷奶牛妊娠。

在還原劑作用后的氯金酸(HAuCl₄)中，金顆粒可以聚合形成一定規(guī)模、帶負(fù)電荷的、疏水性的膠溶液，由于靜電相互作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，因此稱為膠體金。膠體金標(biāo)記本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)的聚合物吸附到膠體金顆粒表面的涂覆工藝。可能的吸附機(jī)理是膠體金顆粒表面帶有負(fù)電荷，與帶正電荷的組蛋白進(jìn)行靜電吸附和固體組合。不同粒徑、不同顏色的膠體金粒子可以通過氯金酸還原法制備。

膠體金球形顆粒對蛋白質(zhì)的吸附功能十分強(qiáng)大。據(jù)報道，膠體金顆粒可以和金黃色葡萄球菌免疫球蛋白、毒素、酶、抗生素、激素、蛋白、牛血清白蛋白多肽綴合物和其他非共價蛋白質(zhì)結(jié)合，因此，膠體金技術(shù)在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中是一個非常有用的工具。

膠體金免疫層析技術(shù)已經(jīng)在人快速妊娠診斷技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用，其原理是將兩個有不同結(jié)合位點特異單克隆抗體分別固定在硝酸纖維素膜的一個線性區(qū)域和干燥的干燥玻璃纖維中，當(dāng)樣品(尿液或血清)經(jīng)過標(biāo)記有特異性抗體膠體金的干燥玻璃纖維時，通過毛細(xì)現(xiàn)象，樣品會在層析條涌動，若樣品中含有相應(yīng)抗原，在其通過玻璃纖維中的金標(biāo)抗體時會發(fā)生第一步免疫反應(yīng)，第一步免疫反應(yīng)復(fù)合物經(jīng)過線性包被區(qū)發(fā)生第二次免疫反應(yīng)，這之后形成的復(fù)合物將不再向前泳動。同時，在線性區(qū)形成顏色條帶(T線)，游離的抗體標(biāo)記物則繼續(xù)涌動，到達(dá)包被著標(biāo)記有二抗的膠體金線性區(qū)域與之結(jié)合而被截留顯現(xiàn)顏色(C線)。因此，如果T線和C線均顯色，檢測樣品為陽性；T線不顯色C線顯色，說明樣品為陰性：C線不顯色，檢測結(jié)果無效。

利用膠體金免疫層析試紙條的這些特點，可以研發(fā)適合在基層養(yǎng)殖單位進(jìn)行早期妊娠快速診斷的PAG1蛋白檢測試紙條產(chǎn)品，以能夠精確、靈敏、快速地診斷母牛妊娠。

要實現(xiàn)這一目的，則需要提供能夠識別PAG蛋白不同抗原表位的可配對的單抗，而目前市場上還沒有此類抗體在售。

本申請人申請?zhí)枮?01710204079.3的專利申請中，涉及了一種氨基酸序列為AsnAsn Ile His Arg Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro CysSer Glu Val Asn Thr的奶牛PAG1多肽，以及以該多肽為抗原免疫動物獲得的多克隆抗體。該奶牛PAG1多肽作為奶牛妊娠檢測試劑使用，特異性好，效價高，為抗PAG1單克隆抗體的制作奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種奶牛PAG1檢測試紙條，以及所述奶牛PAG1檢測試劑條的制備方法。