[發(fā)明專利]一種用于檢測BRCA1和BRCA2基因大片段重組的引物組合、方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710412529.8
• 申請(qǐng)日: 2017-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN107338285B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉建云;汪彪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京明諦生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京元本知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 秦力軍

本發(fā)明公開了一種用于檢測BRCA1和BRCA2基因大片段重組的引物組合、方法及試劑盒，本發(fā)明的引物組合中的每對(duì)引物均可從BRCA1或BRCA2基因至少一個(gè)外顯子所在區(qū)域擴(kuò)增得到一個(gè)特征片段，特征片段長度各不相同，經(jīng)過優(yōu)化后，引物分為5組，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，每組擴(kuò)增產(chǎn)物的長度均具有差異。多重PCR以GeXP?PCR方式進(jìn)行，PCR反應(yīng)前期為特征片段的線性特異擴(kuò)增，后期以通用引物對(duì)特征片段進(jìn)行無差別擴(kuò)增。通用引物中的一條帶上適宜的熒光修飾基團(tuán)，即可于相應(yīng)的毛細(xì)管電泳分析儀器上進(jìn)行分析，獲得各特征片段的相對(duì)含量信息，進(jìn)而獲得相應(yīng)基因區(qū)域的大片段重組突變信息。本發(fā)明所提供的檢測方法具有操作簡單，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，與普通的終點(diǎn)法多重PCR相比，解決了多重?cái)U(kuò)增偏好性問題，提高了可靠性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于檢測BRCA1和BRCA2基因大片段重組的引物組合、方法及試劑盒。

背景技術(shù)

BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，參與染色體損傷修復(fù)過程。BRCA1和BRCA2的突變可能造成基因功能的降低或缺失，進(jìn)而增加細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。現(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示，這兩個(gè)基因的胚系突變是造成遺傳性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突變攜帶者一生中罹患乳腺癌的幾率可高達(dá)87％，卵巢癌的幾率可高達(dá)44％。因此，對(duì)高危人群進(jìn)行BRCA1/2基因突變檢測，對(duì)于癌癥的預(yù)防，發(fā)現(xiàn)和治療有著重要的指導(dǎo)意義。

BRCA1/2的突變分為兩種。第一種是單個(gè)堿基的突變或少量堿基的缺失和插入，可以造成氨基酸序列的改變，翻譯提前終止，或信使RNA加工的異常，進(jìn)而影響蛋白的功能。第二種是大片段DNA重組，可以造成一個(gè)或多個(gè)外顯子的缺失或重復(fù)，從而擾亂基因功能。這兩種突變中，第一種占大部分，并且可通過基因片段PCR擴(kuò)增和Sanger測序相結(jié)合的常規(guī)方法進(jìn)行檢測。第二種占少部分，需要通過Southern雜交，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)，定量PCR或CGH(comparativegenomic hybridization)等較為復(fù)雜的方法來檢測。第二代高通量測序技術(shù)也被運(yùn)用到了BRCA1/2突變的檢測中。通過高通量測序，兩種類型的突變可以被同時(shí)檢測。但是，利用二代測序技術(shù)進(jìn)行大片段DNA重組的檢測，對(duì)基因組目的區(qū)域的富集方式、測序深度和信息分析等都有特定的要求，對(duì)于很多實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的檢測平臺(tái)來說都是非常大的挑戰(zhàn)。所以，一種快速有效的BRCA1/2大片段重組檢測技術(shù)，無論是作為獨(dú)立的大片段重組檢測項(xiàng)目，還是作為常規(guī)點(diǎn)突變檢測的補(bǔ)充，都有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

BRCA1和BRCA2共有48個(gè)外顯子。用Southern雜交或?qū)崟r(shí)定量PCR來檢測工作量大。CGH可同時(shí)檢測整個(gè)基因區(qū)域，但對(duì)技術(shù)平臺(tái)有很高的要求。以多重PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)操作簡單，方便快捷。MLPA技術(shù)被廣泛用于BRCA1/2及許多其它基因大片段DNA重組的檢測，目前還存在數(shù)據(jù)變異較大的缺點(diǎn)，檢測精確度有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明針對(duì)BRCA1和BRCA2的所有外顯子開發(fā)了一套引物，根據(jù)產(chǎn)物片段大小，將一套引物分為五組，利用GeXP原理，通過五組引物對(duì)待測樣本進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增。利用五組引物進(jìn)行多重PCR的產(chǎn)物片段大小分布在180至500bp的范圍之間。利用一條通用引物上的熒光修飾使所有擴(kuò)增片段一端帶上熒光基團(tuán)，通過毛細(xì)管電泳DNA分析儀進(jìn)行片段分析后，通過片段大小識(shí)別特征片段，通過峰高判定每個(gè)外顯子所在區(qū)域的擴(kuò)增強(qiáng)度，進(jìn)而判斷各外顯子在基因組中的拷貝數(shù)和相應(yīng)區(qū)域的大片段重組情況。本發(fā)明所提供的檢測方法具有操作簡單，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第一方面提供一種用于檢測BRCA1和BRCA2基因大片段重組的引物組合，所述引物組合包括：

從其擴(kuò)增區(qū)段包含BRCA1和BRCA2基因的各個(gè)外顯子所在區(qū)域的特征片段的多對(duì)引物中獲得五個(gè)引物組；