[發明專利]一種用于捕食線蟲絲孢菌分子鑒定的標準基因及其應用

在審

• 申請號: 201710406542.2
• 申請日: 2017-06-02
• 公開（公告）號: CN107190061A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 張穎;張克勤;張云潤;董建勇;蔣力力
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 云南派特律師事務所53110
• 代理人: 董建國

技術領域

本發明涉及物種分子鑒定領域，具體涉及一種用于捕食線蟲絲孢菌分子鑒定的標準基因及其應用。

背景技術

植物寄生線蟲病是一類在世界范圍內普遍發生的植物病害，目前已知的根結線蟲種類就有70多種，危害3000多種植物，全球每年因線蟲病造成的損失高達1000多億美元。在線蟲和真菌復雜的相互關系中，專門有一類真菌，它們通過營養菌絲特化的捕食器官來捕捉線蟲，這一類真菌稱為捕食線蟲絲孢菌。根據Zhang等2014年發表的最新版專著，現今已知的捕食線蟲絲孢菌有3個屬96個種，分別是Arthrobotrys屬54個種，Drechslerella屬14個種，Dactylellina屬28個種。隨著漫長的進化演變，其菌絲體為適應生存環境，營養菌絲變態為各種形態獨特、結構精巧的捕食器官，如粘性球、粘性網和收縮環等結構，以便捕食線蟲。就目前來說，生物防治線蟲無疑是最可靠最安全的手段，故捕食線蟲絲孢菌在線蟲生物防治領域中扮演者重要的角色，具有特殊的生態學意義和經濟價值。因捕食線蟲絲孢菌包含無性型屬種多，物種形態特征多樣及其形態可塑性，以及潛在的多元生活史，使得某些物種間沒有明顯的顯微結構差異，且目前對該類真菌的分子系統發育研究不足，故研究者對該類真菌分子系統發育及物種鑒定等方面的問題爭議不斷，也給防治線蟲的生物制劑研發帶來諸多困擾。因此，急需標準基因來建立其快速的分子鑒定，通過形態研究和分子數據相結合的方法來解決其鑒別和分類問題。

發明內容

為克服形態學鑒定捕食線蟲絲孢菌存在的不足，本發明提供了一種捕食線蟲絲孢菌分子鑒定的標準基因序列及鑒定方法，可以快速準確地將該捕食線蟲絲孢菌易混淆物種鑒定出來，從而為線蟲的防治提供快速和有效的鑒定工具。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種用于捕食線蟲絲孢菌分子鑒定的標準基因及其應用，包括COX1標準基因片段的建立和樣品的鑒別步驟；其中：

（1）根據DNA條形碼技術原理，采用PCR擴增方法，確保條帶的純度及可靠性。測序結果通過手工校對、序列拼接，并確保所得序列為標準序列。從采集的捕食線蟲絲孢菌樣品提取基因組DNA，利用引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出樣品的COX1基因，將擴增產物測序后分析比對，SEQ ID NO.1樣本引物序列擴增樣品的COX1基因序列片段作為標準基因。

（2）樣品的鑒別：通過將待鑒別的樣品序列與標準基因進行比對，基于同源性和基于聚類分析的系統發生樹法設立鑒定規則來鑒別物種，獲得序列間的相似性，相似度最高或匹配度最高或遺傳距離最近的對應物種即為待鑒別的物種；具體如下：

a. 基于同源性鑒定規則來鑒別物種

根據測序結果，如果與所述基因序列SEQ ID NO.1核苷酸差異個數在10個以下，即可判斷所述的待測樣品為捕食線蟲絲孢菌的某個物種。

b. 基于聚類分析的系統發生樹法設立鑒定規則來鑒別物種

將標準基因序列和待鑒定的樣品序列與捕食線蟲絲孢菌的COX1基因序列合并應用MEGA或PAUP軟件構建NJ系統發育樹，檢驗未鑒定樣品的DNA 條形碼序列與標準基因序列聚類在一起的物種，若未知樣品與數據庫中的物種構成單支系，則鑒定為該物種。

本發明的優點在于：

1、優選COX1基因作為最適合鑒別捕食線蟲絲孢菌的DNA條形碼，相比于其他基因，COX1序列具有通用、易比對的特點。

2、建立了捕食線蟲絲孢菌的標準基因序列和樣品的鑒別方法，相比于傳統的形態學鑒定方法，大大提高了鑒定效率。該方法對于樣品的完整程度要求低，鑒別指標能夠量化，這對于及時鑒定捕食線蟲絲孢菌提供了有效的依據。此外，運用基于聚類分析的系統發生樹法設立鑒定規則進行鑒定，其鑒定的可靠性和準確性也大大優于常規的分子鑒定方法，彌補了該類捕食線蟲絲孢菌分子鑒定的不足。

附圖說明：

圖1是待鑒定樣品序列及形態學混淆種和COX1標準基因序列基于Kimura-2-parameter模型的遺傳距離構建的NJ樹。

具體實施方式：

下面結合具體的實例對本發明做進一步說明：

實施例1：待測樣品與捕食線蟲絲孢菌DNA條形碼鑒別標準基因片段的同源性鑒定

1、捕食線蟲絲孢菌標本的采集與保存：采集的9份來自云南省的樣品。

2、提取捕食線蟲絲孢菌基因組DNA：采用改進過的CTAB法提取基因組DNA，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到 0.5μg/μl。