[發明專利]一種適于棗染色體倍性測定的細胞核懸浮液快速制備方法

在審

• 申請號: 201710400298.9
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN108982192A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 劉孟軍;劉平;王利虎
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N15/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種適于棗染色體倍性測定的細胞核懸浮液快速制備方法。采集幼嫩葉片，用超純水清洗數次，放入預冷的培養皿中，加入預冷的Tris?MgCl₂裂解液，用刀片迅速切碎，再加入預冷的裂解液，混勻后靜置數分鐘，用紗布過濾進入離心管中，加入RNA酶及PI染液，低溫避光，得到細胞核懸浮液；利用流式細胞儀測定，通過計算目標峰的熒光強度獲得倍性關系。本方法改進了棗染色體樣本制備及倍性鑒定中的多個環節，簡單、快速、準確、成本低，可用于大批量棗染色體倍性的快速檢測。該方法還適用于酸棗和毛葉棗等棗屬植物。

技術領域

本發明屬于倍性育種技術領域，具體涉及一種適于棗染色體倍性測定的細胞核懸浮液快速制備方法。

背景技術

棗樹（Ziziphus jujuba Mill.）是原產我國的特色優勢果樹、第一大干果和五大優勢經濟林之一。但目前棗樹品種結構還不夠合理，大果、早熟、抗病品種缺乏，亟需加速培育綜合性狀優良的棗樹新品種。在棗樹上，由于雜交育種困難，倍性育種成為棗樹重要的育種手段。隨著棗倍性育種研究的不斷深入和成熟應用，快速準確地鑒定試驗材料的染色體倍性變得越來越重要和迫切。

傳統的倍性鑒定方法主要是染色體顯微觀察法和形態觀察法。染色體顯微觀察法最直接、最準確，但存在技術步驟繁瑣、工作量大、成本高、難以進行大規模快速鑒定等問題。形態觀察法主要依據多倍體的“巨大型”特點，但在高倍性時形態表現與倍性并不呈正相關，且表觀形態容易受到環境和樹體狀態等影響，缺乏足夠的準確性，一般只宜作為倍性鑒定的輔助方法或初步鑒定方法。鑒于此，建立一種快速、準確、成本低的棗染色體倍性鑒定方法具有重要價值。近年來，流式細胞術以其制樣簡便、自動化程度高、快速、靈敏并可同時進行多參數檢測等優點廣泛應用于倍性鑒定中，目前已成為植物倍性鑒定中最常用的技術之一。其原理為：經熒光素染色的細胞核，在一定壓力下逐個通過噴嘴，進入流式照射室；經過激光照射，細胞核發射出散射光，最后光信號再轉化成電信號，經數據處理輸入電腦，呈現出點圖和峰圖2種流式圖譜，峰圖縱坐標為粒子數，橫坐標為熒光強度，通過計算目標峰的熒光強度從而獲得倍性關系。流式細胞術判斷染色體倍性的可信度主要取決于以下幾個參數：一，峰圖，主峰明顯，噪音峰較小、背景清晰；二，CV值，動物樣品要求CV值低于3%，植物樣品CV值低于5%即可。但流式細胞術要求檢測樣本具備完整的細胞或細胞核懸浮液，若樣品中細胞碎片雜質多，導至雜峰碎片較多，使雜峰與信號峰不能良好的分離從而影響結果，則峰值直方圖無效。

細胞核懸浮液配制是流式細胞術的關鍵。其過程一般主要分為三步：一，在合適的裂解液中對樣品進行處理，一般為機械破碎；二，對上述得到的液體進行過濾，并與離心相結合除去細胞碎片；三，對所得濾液添加染色劑，即得細胞核懸浮液。但是，在棗上細胞核懸浮液配制還缺乏系統性研究。

本專利發明人以‘臨猗梨棗’和其同源四倍體‘辰光’為材料，系統比較了細胞裂解液種類、葉片成熟度、葉片保存時間、染液用量對檢測效果的影響。研究發現，3種裂解液（WPB，Tris-MgCl₂，GPB）均能使‘臨猗梨棗’產生信號峰，但WPB裂解液細胞碎片多，不能使‘辰光’產生主峰，裂解效果最差，其他2種裂解液均能使‘辰光’產生清晰的主峰，細胞碎片較少，可以準確的判斷出倍性關系。Tris-MgCl₂與GPB相比較，CV值均低于5%，但在測定四倍體‘辰光’時，利用Tris-MgCl₂的CV值低于3%，明顯優于GPB，且配制方便，成本低廉。因此，Tris-MgCl₂被選為棗染色體倍性鑒定的最佳裂解液。

為選擇適用棗染色體倍性鑒定的最佳葉片狀態，對幼嫩、成熟葉片和老化葉片進行了比較。結果顯示老化葉片未能產生明顯的主峰，幼嫩、成熟葉片均能產生明顯的主峰，但前者主峰清晰，背景碎片較少，與雜峰分離度良好且CV值明顯優于后者。據此提出適用于棗染色體倍性鑒定的最佳葉片狀態為幼嫩葉片。