[發明專利]標記細菌菌群樣品的試劑盒、方法及應用

有效

• 申請號: 201710399645.0
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN108982430B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 陳興;王煒
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12N1/20
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 趙囡囡;吳貴明

本發明提供了一種標記細菌菌群樣品的試劑盒、方法、帶熒光標記的細菌菌群及其應用。試劑盒包括利用第一類熒光探針和第二類熒光探針對細菌菌群中的菌種進行標記，其中，第一類熒光探針特異性標記革蘭氏陽性菌，第二類熒光探針特異性標記革蘭氏陰性菌，且第一類熒光探針和第二類熒光探針分別帶有不同的熒光標記。采用基于窄譜抗生素的高特異性結合兩類菌種的熒光探針，可以利用兩種熒光標記的互補結合，相互印證，避免僅基于一類熒光探針來對兩類細菌分類所導致的誤判，從而大大提高標記的可信度。此外，還有利于更準確地統計不同熒光探針組合對細菌菌群的標記覆蓋度，進而更有利于評價熒光探針組合在標記細菌菌群中的優劣。

技術領域

本發明涉及細菌熒光標記領域，具體而言，涉及一種標記細菌菌群樣品的試劑盒、方法、帶熒光標記的細菌菌群及其應用。

背景技術

針對組成未知的細菌樣品進行初步的鑒別觀察有很大的科研和臨床應用價值。目前常用的細菌染色、標記、成像觀察主要有傳統革蘭氏染色、熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization，FISH)、區分性核酸染色(根據不同細菌細胞膜穿透性不同)、麥胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)染色標記革蘭氏陽性菌細胞壁等方法。

在醫院環境中的臨床細菌樣品，例如病人的痰液、肺部灌洗液、膿液、體液(血液、尿液、腦脊液)等，目前的常規操作仍是需要進行革蘭氏染色。通過革蘭氏陽性/陰性菌細胞外膜的結構不同而最終在光學顯微鏡的明場下呈現不同的顏色(陽性菌為紫色，陰性菌呈紅色)，并結合形態學觀察以進行初步的細菌學診斷。

在科研環境中，針對復雜細菌樣品，包括各類宿主的細菌菌群(例如近年研究火熱的哺乳動物腸道細菌)、環境細菌菌群(土壤、水體、原油細菌等)，目前最可行的方式是使用FISH探針，利用針對細菌16s rRNA的含有熒光基團的DNA探針，來對特定的固定后的細菌種類進行標記成像觀察(利用熒光顯微鏡)。

出于各類科學研究的目的，已有一些基于抗生素的細菌標記熒光探針見諸報道。用于細菌成像觀察的一類主要是基于萬古霉素(特異性抗革蘭氏陽性菌)抗生素的熒光探針，文獻中的應用主要是用來對某種細菌細胞壁的結構進行成像觀察。也有一些報道通過列舉比較標記幾種常見細菌種類，提到了這類探針可以特異性地標記幾個革蘭氏陽性菌物種。另一類見諸報道的為基于多粘菌素的探針，主要涉及到的為研究此類抗生素的作用機制與藥物動力學方向。其中兩種探針Vancomycin-BODIPY和Polymyxin-BODIPY市場曾經有售。

革蘭氏染色這種方法自1884年由Hans Christian Gram發明之后，其基本操作原理一直沿用至今。這種染色方法存在某些細菌種類染色后顏色結果不明確，染色結果受人為操作因素影響較大(染色過程中沖洗的步驟較多，往往需要靠經驗判斷每一步的操作細節和程度)，僅能對固定之后的細菌進行操作(活的細菌無法應用)，在處理含有非細菌雜質的樣品時容易受雜質的染色背景影響等問題。

FISH探針的試劑盒存在DNA探針設計復雜、低rRNA含量、操作繁瑣、信噪比低等問題，也是僅能對固定之后的細菌進行操作，并且只限于檢測事先知其存在且引物可行性已驗證的細菌，故其應用仍受很多限制。

盡管文獻中已報道的抗生素熒光探針種類包括基于多粘菌素的探針和基于萬古霉素/雷莫拉寧的探針。這些探針僅限于對某些特定已知細菌種類的標記成像。而針對如腸道細菌菌群等復雜細菌體系或復雜細菌樣品(指含有兩種或兩種以上細菌物種，且種類未知，且可能含有非細菌類的污染物)樣品中的細菌進行標記或成像鑒別，現有技術中目前還沒有很好的解決辦法。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種標記細菌菌群樣品的試劑盒、方法、帶熒光標記的細菌菌群及其應用，以解決現有技術中難以對復雜細菌體系進行準確標記的問題。