[發明專利]一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法

在審

• 申請號: 201710399223.3
• 申請日: 2017-05-31
• 公開（公告）號: CN107024524A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 李科;王桂臻;王迪;秦雪梅
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/34;G01N1/40
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司)14105
• 代理人: 雷立康

技術領域

本發明涉及一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，具體屬于熒光輔助凝膠電泳技術，以黃芪多糖部分酸水解后差異性糖片段的含量為鑒定依據的移栽黃芪和野生黃芪的鑒別方法。

背景技術

傳統的野生黃芪主要是指生長年限在5年以上、自然繁殖或人工撒種后自然生長的蒙古黃芪或膜莢黃芪。野生的蒙古黃芪主要分布在山西、內蒙、甘肅、陜西等省，其中山西和內蒙古產的5～8年生的蒙古黃芪為道地藥材，具有“主根粗長、少分支、綿性大、粉性強、甜味足、豆腥味濃”等特點。野生膜莢黃芪主產區為黑龍江、吉林，生長年限在6年以上，商品量極小。移栽黃芪主要是指生長年限在1～3年、人工栽培的蒙古黃芪或膜莢黃芪。生長2～3年的移栽黃芪主要分布在甘肅、寧夏、內蒙古等省，以蒙古黃芪為主；河北、山東也有栽培一年即采收上市的膜莢黃芪。這種移栽黃芪外觀與野生黃芪有較大差別，呈現“主根短，分枝多，質堅硬，雞爪形，微甜而淡”等特征。二者的化學成分有差異導致其藥效不同，雖然黃芪根部形態特征有明顯區別，但制備成飲片或打粉后，肉眼難以區別。因此，近年來藥材市場上出現了兩種黃芪混雜現象，擾亂了中藥材市場。

臨床研究表明，糖類成分是黃芪發揮免疫調節作用的主要物質。因此，將糖類成分作為黃芪質量控制與品質評價的標準，具有良好的研究前景和意義。國內外學者也采用苯酚硫酸法測定總多糖含量比較不同生長年限、不同栽培方式的黃芪，然而，所測定的指標缺乏專屬性特征，限制了應用多糖作為黃芪鑒別的方法。授權公告號為104122287B的發明專利公開了一種野生黃芪和栽培黃芪的鑒別方法，該方法通過核磁技術獲得黃芪藥材的核磁共振氫譜，對蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖信號分別進行手動積分，計算蔗糖和葡萄糖的積分面積比值，根據比值的范圍鑒別野生黃芪和栽培黃芪。申請公布號CN106093240A公開了一種速生黃芪和野生黃芪的鑒別方法，該方法利用氣相色譜質譜技術分析黃芪中細胞壁糖類成分，從而區分速生黃芪和野生黃芪。上述方法中使用核磁技術和氣相色譜質譜技術，其實驗成本高、操作復雜而且實驗數據處理較為繁瑣，不適于普及和推廣。

發明內容

本發明的目的是解決現有移栽黃芪和野生黃芪鑒別方法專屬性低、操作復雜、實驗成本高的技術問題，提供一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，包括如下步驟：

1)原料預處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過100目篩得到黃芪細粉，備用；

2)提取粗多糖：取上述黃芪細粉加水后在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘渣再加水重復提取1次，取上清，合并上清液；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調節至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；

3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質量比為1:200，向多糖粗粉溶液中加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；

4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應結束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產物，然后加入適量甲醇清洗水解產物，繼續氮氣吹干；

5)多糖酸水解產物、三糖標準品和四糖標準品的衍生化：取三糖標準品6mg、四糖標準品8mg以及步驟4)中的多糖酸水解產物，分別加入200μL的NaCNBH3溶液，再分別加入200μL的ANTS衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應15h后，將三種產物用氮氣吹干，溶于1mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖標準品、四糖標準品及多糖酸水解產物的衍生化樣品，其中三糖標準品和四糖標準品的衍生化樣品用6mol/L的尿素溶液分別稀釋成不少于6個濃度梯度的衍生化樣品；

6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和四糖標準品的衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個衍生化樣品，分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為pH8.0-9.0、濃度0.1-0.2mol/L的Tris-boric，上樣量為1-3μL，凝膠在UV300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產物衍生化樣品、三糖標準品衍生化樣品和四糖標準品衍生化樣品的電泳圖；