[發(fā)明專利]一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710399223.3
• 申請(qǐng)日: 2017-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107024524A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李科;王桂臻;王迪;秦雪梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/447
• 分類號(hào): G01N27/447;G01N1/34;G01N1/40
• 代理公司: 山西五維專利事務(wù)所(有限公司)14105
• 代理人: 雷立康

1.一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過(guò)100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；

2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉加水后在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀貜?fù)提取1次，取上清，合并上清液；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；

3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液中加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；

4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?/p>

5)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、四糖標(biāo)準(zhǔn)品8mg以及步驟4)中的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μL的NaCNBH3溶液，再分別加入200μL的ANTS衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈桑苡?mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、四糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/L的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；

6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品，分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為pH8.0-9.0、濃度0.1-0.2mol/L的Tris-boric，上樣量為1-3μL，凝膠在UV300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；

7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入Quantity One軟件，經(jīng)過(guò)處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和四糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

8)移栽黃芪和野生黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和四糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別移栽黃芪和野生黃芪：

當(dāng)三糖含量＜3.0mg/mL，且四糖含量＜3.2mg/mL時(shí)，為移栽黃芪；

當(dāng)三糖含量＞3.0mg/mL，且四糖含量＞3.2mg/mL時(shí)，為野生黃芪。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，其特征在于：步驟2)中所述黃芪細(xì)粉與水的質(zhì)量比為1:100。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，其特征在于：步驟2)中所述殘?jiān)c水的質(zhì)量比為1:80。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，其特征在于：步驟6)中分離膠和濃縮膠的配制溶劑為pH8.0～9.0、濃度0.1～0.2mol/L的Tris-boric緩沖液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別移栽黃芪和野生黃芪的方法，其特征在于：步驟6)中的電泳分離過(guò)程分兩步進(jìn)行，首先采用60-80V的分離電壓電泳分離40-60min，隨后采用100-200V的分離電壓電泳分離100-120min。