[發明專利]一種山羊細管凍精制作方法

有效

• 申請號: 201710381077.1
• 申請日: 2017-05-25
• 公開（公告）號: CN107183007B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 施力光;李義書;周漢林;侯冠彧
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 胡堅

1.一種山羊細管凍精制作方法，其特征在于，該方法具體操作步驟如下：

(1)冷凍稀釋液的準備：無菌條件下，將冷凍精液稀釋液預溫于34-36℃水浴中；

(2)采精和鏡檢：采用電刺激法或假陰道法采集山羊精液，對精液品質進行常規：鮮精活力不低于65％、活率不低于60％、密度不低于10 ⁸個/ml；

(3)稀釋：按照山羊射精量與冷凍稀釋液1:1的比例將步驟(1)預溫的冷凍稀釋液緩慢倒入步驟(2)檢測合格的鮮精中，進行第一次稀釋，并搖晃均勻，避光放于室溫環境靜置30-60min，再用步驟(1)預溫的冷凍稀釋液進行第二次稀釋，稀釋方法同前，即預溫的冷凍稀釋液緩慢倒入精液中，并搖晃均勻，稀釋比例通常1:(5至8)，精液稀釋最終密度不低于10 ⁶個/ml；

(4)分裝：將步驟(3)稀釋后的精液分多段吸入細管進行精液分裝，即先吸入部分稀釋精液后吸取部分空氣再吸取部分稀釋精液；

(5)平衡：經步驟(4)分裝好的細管精液，平放用6-8層的無菌紗布包裹，置于2-5℃冰箱中避光平衡2-2.5h；

(6)冷凍：在泡沫箱中加注液氮，并將步驟(5)平衡后的細管精液平鋪于冷凍架上，液氮面與細管精液保持2.5-3cm的距離，熏蒸冷凍至少8min，冷凍結束后將細管精液快速移入液氮中；

(7)解凍和復檢：將步驟(6)的細管凍精從液氮中撈出，快速投入36-37℃的恒溫水浴中解凍15-20s，將細管中精液充分混勻后對精液品質進行常規檢查，解凍后活力不低于35％、活率不低于50％、密度不低于10 ⁶個/ml可用于人工授精或長期冷凍保存；

所述步驟(3)對鏡檢合格的鮮精采用2次稀釋法進行稀釋，第一次稀釋是按照射精量與稀釋液等體積1:1稀釋，第二次稀釋是根據精子密度進行定量稀釋，且兩次稀釋方法是都將稀釋液緩慢倒入精液并混合均勻；

冷凍稀釋液的制備：無菌條件下，按照下述方法配制冷凍稀釋液，準確稱取Tris3.07g、果糖1.26g、檸檬酸1.64g、青霉素100000IU、鏈霉素0.1g、甘油5mL、磷脂酰膽堿1.6g和膽固醇0.4g加入85ml雙蒸水中，調節pH 6.8-7.0，加入雙蒸水定容至100mL，經0.22μm孔徑的無菌濾器過濾，無菌條件分裝至50ml離心管并預溫于34℃水浴中。

2.根據權利要求1所述的山羊細管凍精制作方法，其特征在于，分裝完成后用封口粉標記。

3.根據權利要求1所述的山羊細管凍精制作方法，其特征在于，所述步驟(6)細管精液位于液氮面上方2.5-3cm處進行熏蒸冷凍，冷凍時間8min-10min，通過超低溫溫度計測定熏蒸1min時細管精液溫度降至-60℃以下，熏蒸2min時細管精液溫度可降至-80℃以下，熏蒸4min時細管精液溫度可降至-96℃以下，熏蒸8min時細管精液溫度-130℃以下。