[發明專利]一種從土壤中特異性分離酸桿菌的方法

在審

• 申請號: 201710362569.6
• 申請日: 2017-05-22
• 公開（公告）號: CN107058107A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 李慧;姚飛;楊山;王志瑞;姜勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及的領域為現代分子生物學技術和微生物技術的交叉領域，具體的說為一種基于特異性引物-PCR結合改良后的基本培養基平板特異性分離酸桿菌的方法。

背景技術

酸桿菌(Acidobacteria)最初的發現是由日本的Kishimoto等于1991年發現，酸桿菌作為土壤微生物群落中的重要組成部分，其相對豐度僅次于土壤中的變形菌門，約占土壤細菌總量的20～50％，而在某些特定環境中，如栗樹根際土壤中，作為土壤中的絕對優勢微生物類群，其相對豐度可達到65％。酸桿菌門在環境的分布極為廣泛，包括自然環境以至于一些極端環境與污染環境，而且酸桿菌在驅動土壤物質循環和生態環境構建過程當中具有重要的生態學意義。

近幾年的研究發現根據系統發育研究結果可以將酸桿菌下分為27種不同綱水平微生物。對土壤微生物宏基因組測序表明，酸桿菌具有降解植物中纖維素相關基因，以此推測在環境較為惡劣的情況下，如酸性、低溫環境中，相比于其他微生物，對惡劣環境強適應性的酸桿菌所具備的纖維素降解能力就尤為突出；酸桿菌對于所處生境中的鐵元素循環也起到積極作用，如可在葡萄糖發酵過程中形成Fe(Ⅱ)，為發酵過程中的其他微生物提供必要的養分。

酸桿菌的純化菌株很難通過人工培養獲得，因此對于該類群微生物的表型、生理特征以及機理研究極為稀少。近年來針對酸桿菌的研究多是以分子生物學手段為基礎，通過16S rDNA對酸桿菌的遺傳多樣性開展了諸多研究。但是關于通過培養實驗以快速獲得酸桿菌單菌株的方法尚未見報道，極大的影響了對于酸桿菌的生態學價值的研究，并降低了探索其潛在其他價值的可能性。

目前，國內外以16S rDNA為基礎對酸桿菌開展的研究多是以細菌的通用引物為主，而細菌的通用引物雖然可以在門水平上為微生物多樣性的劃分提供依據，但是在更為精細的分類水平上，則需要設計針對該門類微生物的特異性引物。因此目前仍然缺乏具備足夠特異性的高效引物完成對酸桿菌16S rDNA的特異性擴增。

發明內容

本發明旨在提供一種基于特異性引物-PCR結合改良后的MM平板特異性分離酸桿菌的方法。

為完成以上目標，本發明的基本方案為：

一種基于門水平的特異性引物-PCR結合改良后的基本培養基平板特異性分離酸桿菌的方法。方法為，將樣品懸濁液稀釋涂布到改良后的固體基本培養基平板，選擇白色單菌落繼續采用連續劃線平板法純化，將純化后的單菌落經液體培養基擴大培養，提取基因組DNA，應用酸桿菌門特異性引物PCR擴增16S rDNA片段，若得到片段大小為1462的陽性擴增產物，即表明篩選得到該樣品中的酸桿菌。

酸桿菌門特異性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

具體操作方案為：

1)土壤懸濁液的制備：首先稱取5g待測土壤至于50ml已滅菌的錐形瓶并添加少量玻璃珠，而后向其中加入45ml生理鹽水于150rpm條件下振蕩90min，使土壤微生物充分溶于生理鹽水中；振蕩結束后，于室溫下靜置30min，采用生理鹽水對靜置后的土壤上清液按照10倍的梯度進行連續稀釋；

2)涂布稀釋后的上清液至改良后的MM固體培養基：吸取上一步中得到的稀釋后的樣液(稀釋度以10-4為宜)，采用涂布平板法涂布，于30℃下培養3～6天；

3)連續劃線平板法純化：接種環挑取上一步中得到的單菌落，在改良后的固體基本培養基上連續劃線以達到分離純化的目的；

4)純培養菌株基因組DNA的提取：將步驟3中分離純化后得到的單菌落接種于改良后的液體基本培養基，30℃下150rpm振蕩培養過夜，而后采用溶菌酶、蛋白酶K和氯仿/異戊醇提取純培養菌株的基因組DNA；

5)特異性引物擴增純菌株的16S rDNA片段：采用特異性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，以步驟4中提取得到的純培養菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增后的產物經由2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若成功得到陽性PCR產物且擴增片段大小為1462bp，即可證明篩選得到酸桿菌，若未獲得陽性PCR產物則證明未篩選得到酸桿菌(原因可能為土壤中酸桿菌含量過低，致使篩選未成功)。