[發明專利]一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑒定方法

有效

• 申請號: 201710354083.8
• 申請日: 2017-05-18
• 公開（公告）號: CN107164471B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 劉吉平;劉健霞;陳杰湖;李香霖;何青;李峙賢;劉希;呂思行;米紅霞
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

本發明公開了一組快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的引物組以及分子鑒定方法。所述引物組序列分別如SEQ ID NO.1～2所示。本發明在完成對廣東株白僵菌線粒體全基因組序列的高通量測序和多個蟲草科物種的線粒體全基因組生物信息學比較分析的基礎上，比較白僵菌線粒體基因序列在地理種屬上的差異，發現白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯；并基于此設計篩選得到了1對能特異檢測白僵菌的引物，建立了高效、快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑒定方法，方法簡便快速、特異性好，靈敏度高，且適用性廣，可實現對不同產地僵蠶中白僵菌真偽的鑒別；為中藥材僵蠶的質量標準化和規范化以及臨床用藥安全提供了技術支持。

技術領域

本發明屬于物種鑒定及中藥材真偽鑒別技術領域。更具體地，涉及一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑒定方法。

背景技術

白僵蠶(Bombyx mori)，蠶蛾科昆蟲家蠶(Bombyx mori Linnaeus)4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌beauveria bassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥體(國家藥典委員會，2015)。白僵蠶中的白僵菌是一類寄生于昆蟲的病原真菌，據NCBI最新數據報道，將白僵菌歸類于：雙核亞界(Dikarya)、子囊菌門(Ascomycota)、盤菌亞門(Pezizomycotina)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌亞綱(Hypocreonycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、蟲草菌科(Cordycipitaceae)、蟲草屬(Cordceps)。

白僵蠶作為我國傳統的中藥材，具有降血糖、降血脂、抗癌、抗驚厥、抗凝、抑菌、鎮靜催眠、美白等多種藥理作用，從而使得其在臨床治療上具有重要的作用。目前農戶養殖僵蠶所帶來的收益是很可觀的，可以作為農民致富的好途徑(張偉基，2016)。然而，由于僵蠶具有重要的藥理作用和良好的經濟效益，使得一些商家為了獲得更多利益，開始用假冒和不合格僵蠶充當合格僵蠶。目前傳統的偽品僵蠶大多為用石灰水將死家蠶摻白加工而成(趙啟有，1998)，也有將地蠶冒充正品僵蠶使用(胡大澤等，2003)，近年來，出現了新的偽品黑死蠶和空心僵蠶。由于偽品僵蠶的外觀、顯微等均與正品相似，難以應用常規方法進行有效鑒別，為了杜絕該類現象的出現，其真偽鑒別在白僵蠶質量評定工作上顯得尤為重要。

目前現行的僵蠶質量鑒定方法主要包括兩種，一是物理鑒定方法，包括外觀鑒別和顯微觀察(徐國均等，1996；國家藥典委員會，2015)、微量升華法(黃曉雪，2005)、SDS-PAGE(邱乙，2014)、灰色關聯度分析法(李峰，2011)、紫外指紋圖譜(冀憲領，2006)、紅外指紋圖譜(冀憲領，2007)、高效液相色譜法(王更先，2006)等方法對僵蠶藥材質量進行鑒定；二是分子鑒定方法，主要是賈靜(2016)等基于COI序列和ITS序列分別對僵蠶藥材的基原物種家蠶和白僵菌進行鑒定，從而對白僵蠶的質量及品質進行鑒定。其中，分子鑒定具有更準確、操作簡便等特點，應用前景更好。

目前對僵蠶中白僵菌真偽鑒定方面，一直缺少特異驗證白僵菌的引物，缺乏一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑒定方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有僵蠶真偽鑒定技術的缺陷和不足，完成對廣東株白僵菌線粒體全基因組序列的高通量測序，比較白僵菌線粒體基因序列在地理種屬上的差異，發現白僵菌的核糖體蛋白基因rps3變異明顯；并基于白僵菌線粒體rps3基因序列設計引物，尋找特異擴增真菌白僵菌的引物，提供一種特異鑒定白僵菌的分子標記方法，從而快速鑒別僵蠶中白僵菌的真偽，為中藥材僵蠶臨床用藥安全工作上提供分子技術支持。

本發明的目的是提供白僵菌的核糖體蛋白基因rps3序列。

本發明另一目的是提供一組鑒定驗證僵蠶中白僵菌真偽的引物組。

本發明再一目的是提供一種快速鑒別中藥材僵蠶中白僵菌真偽的分子鑒定方法。