[發明專利]一種酒瓶蘭試管苗種質保存方法

有效

• 申請號: 201710345525.2
• 申請日: 2017-05-17
• 公開（公告）號: CN107018905B
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發明（設計）人: 李晶瑤
• 申請（專利權）人: 天津潤松生態科技發展有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種酒瓶蘭試管苗種質保存方法，其特征在于：該種質保存方法的詳細步驟如下：

1）酒瓶蘭幼株預處理：

將生長健壯、無病蟲害、基部帶側枝的盆栽酒瓶蘭植株置于5-6℃低溫培養箱中，低溫黑暗處理4-6d，然后掰下側枝，將側枝基部浸入裝有0.01g/L的多氯苯甲酸溶液中，5-6℃低溫預處理3-4天；

2）外植體取材、消毒與接種

將預處理后的酒瓶蘭側枝超純水洗凈后轉入超凈工作臺進行無菌操作，剝去葉片，露出酒瓶蘭嫩莖，將嫩莖先用濃度為75%酒精浸泡30s，然后投入加入了數滴吐溫80的0.1%升汞溶液中，表面消毒12-15m后用滅菌水沖洗3-5次，濾紙吸干，將嫩莖用滅菌解剖刀分割成0.8-1.2cm的小莖段，然后將小莖段正向接種于裝有誘導培養基的三角瓶中；

3）不定芽誘導

培養室溫度控制為26±1℃，光照強度控制為1200-1500Lx，光周期控制為光12h/暗12h，30-35天誘導出不定芽；

4）慢生長增殖保存種質：

將不定芽接種至慢生長增殖培養基A或慢生長增殖培養基B中，然后將三角瓶轉移到低溫、弱光條件下緩慢生長，12個月繼代接種一次，慢生長增殖培養基A和慢生長增殖培養基B繼代接種交替使用，然后繼續進行慢生長增殖步驟；

5）復壯

當酒瓶蘭種質保存期結束，需要進行酒瓶蘭不定芽復壯，將慢生長增殖的不定芽轉接入復壯培養基，然后轉移到溫度控制26±1℃，光照強度控制為1200-1500Lx，光周期控制為光12h/暗12h，獲得健壯的酒瓶蘭不定芽；

6）不定芽壯根后移栽：

將酒瓶蘭不定芽轉接到壯根培養基中，控制溫度為23-25℃、光照強度為2000-2500 Lx培養條件下生長18-24天誘導生根，然后打開培養瓶煉苗7-10天后移栽入溫室；

所述步驟2）中誘導培養基配方為：MS＋2，4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖40g/L+氯化2-羥乙基三甲銨0.3g/L+水解蛋白0.6g/L+活性炭1.5g/L+瓊脂6.5g/L，pH 5.8-6.0；

所述步驟4）中的慢生長增殖培養基A的配方為：KNO₃ 2200～2600mg/L，NH₄NO₃ 1600～1800mg/L，KH₂PO₄ 160～180mg/L，CaCl₂?2H₂O 430～450mg/L，MgSO₄?7H₂O 360～380mg/L，Na₂-EDTA 30～35mg/L，FeSO₄?7H₂O 22～26mg/L，MnSO₄?4H₂O 21～24mg/L，ZnSO₄?7H₂O 8～9mg/L，H₃BO₃ 0.1～0.2mg/L，KI 0.6～0.8mg/L，肌醇90～110mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，白喉霉素0.6～0.8mg/L，維生素B1 0.35～0.45mg/L，維生素B6 0.45～0.55mg/L，蔗糖23～27g/L，甘露醇27～33g/L，植物凝膠5.2～5.8g/L，NAA 0.15～0.25mg/L，2，4-D 0.8～1.2mg/L，調環酸鈣0.9～1.1mg/L，山梨醇23～27g/L，水解蛋白0.9～1.1g/L，pH 5.8-6.0；

所述的慢生長增殖培養基B的配方為：KNO₃ 2200～2600mg/L，NH₄NO₃ 1600～1800mg/L，KH₂PO₄ 160～180mg/L，CaCl₂?2H₂O 20～30mg/L，MgSO₄?7H₂O 360～380mg/L，Na₂-EDTA 30～35mg/L，FeSO₄?7H₂O 22～26mg/L，MnSO₄?4H₂O 21～24mg/L，ZnSO₄?7H₂O 0.1～0.2mg/L，H₃BO₃5～6mg/L，KI 0.6～0.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.04～0.06mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.15～0.2mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.15～0.2mg/L，肌醇90～110mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，白喉霉素0.6～0.8mg/L，維生素B1 0.35～0.45mg/L，維生素B6 0.45～0.55mg/L，蔗糖23～27g/L，甘露醇27～33g/L，植物凝膠5.2～5.8g/L，NAA 0.15～0.25mg/L，2，4-D 0.8～1.2mg/L，調環酸鈣0.9～1.1mg/L，山梨醇 23～27g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L，pH 5.8-6.0；

所述步驟4）中的低溫、弱光條件為：培養溫度控制為6-8℃，光照強度控制為500-600lx，光周期控制為光12h/暗12h；

所述步驟5）中的復壯培養基的配方為：MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+3%蔗糖+0.8g/L水解蛋白+5.5g/L植物凝膠，pH 5.8-6.0；

所述步驟6）中的壯根培養基的配方為：1/2MS+多效唑0.1mg/L+蔗糖15g/L，pH為5.8。

2.根據權利要求1所述的酒瓶蘭試管苗種質保存方法，其特征在于：所述步驟4）中的繼代次數不超過4次。