[發(fā)明專利]一種檢測多種蟲媒病毒和無脊椎動物感染病毒的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710345060.0
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN108866238B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝良志;孟淑芳;孫春昀;劉茜;吳雪伶;徐苗;李久鳳;樊金萍;王保;趙翔;馮建平
• 申請（專利權(quán)）人: 北京義翹神州科技股份有限公司;中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發(fā)明提供一種檢測多種蟲媒病毒和無脊椎動物感染病毒的試劑盒，屬于熒光PCR檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明試劑盒含有針對11個無脊椎動物病毒科和5個蟲媒病毒科共158種病毒的35對特異性引物、35個陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、熒光PCR反應(yīng)液和無菌H₂O，所述35對特異性引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1?70所示；陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.71?105所示。本發(fā)明試劑盒能快速檢測上述各類蟲媒病毒和無脊椎動物感染病毒，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、檢測結(jié)果可靠穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)的昆蟲病毒安全性檢測，提高藥品安全性，在生物制品生產(chǎn)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用熒光-PCR反應(yīng)技術(shù)檢測昆蟲細(xì)胞多種無脊椎動物感染病毒和蟲媒病毒的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蟲媒病是指以吸血的節(jié)肢動物作為媒介通過叮咬感染造成人和人、人和動物間傳播的一種疾病。動物臨床表現(xiàn)為突然發(fā)熱、感覺酸疼無力、大面積皮疹、繼發(fā)性感染造成死亡等。該病過去曾使成千上萬的人畜感染甚至死亡，給經(jīng)濟(jì)和人類社會發(fā)展帶來了一定的負(fù)面影響。20世紀(jì)中葉后，隨著全球往來加強(qiáng)，也促進(jìn)了國際動物貿(mào)易不斷發(fā)展，特別是現(xiàn)代化交通工具的使用縮短了世界各地的距離，這些因素為蟲媒病的遠(yuǎn)距離傳播和在全球范圍內(nèi)擴(kuò)大流行的趨勢提供了更廣泛的可能性。目前，隨著國際交往的日益頻繁，蚊、蜱、蠓等媒介傳入我國邊境口岸的風(fēng)險非常大，蟲媒性動物疫病的爆發(fā)也有可能隨生物蟲媒傳入我國。

采用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)作為蛋白生產(chǎn)平臺已有多個產(chǎn)品嘗試，其中GSK公司的CervarixHPV(人乳頭瘤病毒)疫苗和Protein Science公司的FluBlok流感疫苗已在國外上市。監(jiān)控昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)的安全性，建立昆蟲細(xì)胞外源病毒質(zhì)控體系，是控制藥物安全性的重要方法之一。

與哺乳動物細(xì)胞的病毒風(fēng)險譜考慮不同，昆蟲細(xì)胞的病毒安全性評價除考慮常規(guī)的病毒風(fēng)險外，必須同時考慮昆蟲的特定病毒風(fēng)險，包括無脊椎動物病毒和蟲媒病毒，如目前有文獻(xiàn)報道HighFive細(xì)胞中存在野田村病毒(nodaviruses)的感染、Sf9細(xì)胞中有彈狀病毒(rhabdoviruses)的感染，因此建立建立無脊椎動物病毒和蟲媒病毒的檢測方法對于控制藥物生產(chǎn)的安全性至關(guān)重要。

無脊椎動物感染病毒包括：(1)Ascoviridae囊泡病毒科，(2)Iridoviridae虹彩病毒科，(3)Poxviridae痘病毒科，(4)Polydnaviridae多分DNA病毒科，(5)Baculoviridae桿狀病毒科，(6)Parvoviridae細(xì)小病毒科，(7)Birnaviridae雙核糖核酸病毒科，(8)Reoviridae呼腸孤病毒科，(9)Nodaviridae羅達(dá)病毒科，(10)Picornaviralses微核糖核酸病毒科(Dicistroviridae二順反子病毒科)，(11)Tetraviridae四病毒科。蟲媒病毒包括：(1)Reoviridae(orbiviruses)呼腸孤病毒科(環(huán)狀病毒科)，(2)togaviruses披膜病毒科，(3)flaviviruses黃病毒科，(4)Bunyaviruse布尼亞病毒科，(5)asfarviruses豬瘟病毒。

熒光PCR是一種直接檢測核酸并可進(jìn)行定量的分子生物學(xué)技術(shù)。具有特異性好、靈敏度高、精確性好、操作簡單和防污染等優(yōu)點(diǎn)。它是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。本發(fā)明采用不同種熒光PCR的方法對樣本核酸進(jìn)行擴(kuò)增檢測，以鑒定樣品中是否有蟲媒病毒和無脊椎動物病毒的感染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用熒光PCR對昆蟲細(xì)胞及由其制備的樣本中蟲媒病毒和無脊椎動物病毒污染檢測的試劑盒，利用本試劑盒可以快速、準(zhǔn)確的檢測樣品是否有蟲媒病毒和無脊椎動物病毒感染。

本發(fā)明首先提供了檢測蟲媒病毒和無脊椎動物感染病毒的特異性引物對組合，包括如下：