[發(fā)明專利]新的賴氨酸脫羧酶突變體及其應用

有效

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• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107164352B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設計）人: 孫際賓;趙晶;劉嬌;孫村民;鄭平;馬延和
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12P13/00;C12N15/63
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;陸鳳

本發(fā)明公開了新的賴氨酸脫羧酶，其氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列突變而來，在選自下組的一個或多個氨基酸殘基位點發(fā)生突變：9位、44位、88位、111位、176位和230位。本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸產(chǎn)生1,5?戊二胺的活性顯著提高，從而可以降低催化劑的用量最終降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明還提供了包含所述賴氨酸脫羧酶的編碼序列的表達載體、包含能夠表達所述賴氨酸脫羧酶的宿主細胞以及它們在產(chǎn)生1,5?戊二胺中的用途和生產(chǎn)方法。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域。具體地說，本發(fā)明涉及具有高活性的賴氨酸脫羧酶、包含該賴氨酸脫羧酶編碼基因的表達載體和能夠表達該賴氨酸脫羧酶的基因工程菌，以及所述賴氨酸脫羧酶、表達載體和基因工程菌在生產(chǎn)1,5-戊二胺中的應用。

背景技術

1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺和尸毒素，是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，是賴氨酸在賴氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.18)的作用下脫羧產(chǎn)生的，反應為L-lysine+H⁺→CO₂+cadaverine。

1,5-戊二胺具有各種各樣的功能及用途。例如，在農(nóng)業(yè)上，1,5-戊二胺可用于調(diào)控植物衰老過程、促進雌雄蕊的發(fā)育、改善植物果實發(fā)育、提高果實產(chǎn)量。在醫(yī)學上，它可作為一種有效治療痢疾的藥物，也是一種重要的藥物中間體。在工業(yè)上，1,5-戊二胺是一種重要的化工原料；將1,5-戊二胺與二元酸進行聚合反應可合成優(yōu)質(zhì)高分子材料-新型尼龍，1,5-戊二胺基不依賴于石油原料的生物制造工藝可能對尼龍工業(yè)產(chǎn)生顛覆性的影響。

尼龍66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，與尼龍6同為尼龍兩大品種之一。目前，己二胺或其合成前體己二腈國內(nèi)主要依賴進口。1,5-戊二胺與己二胺互為同系物，在結(jié)構(gòu)上與己二胺非常相似，可以替代己二胺，和二元酸共聚合成具有實用性的尼龍5X(4、6、10等)。尼龍56性能媲美經(jīng)典的尼龍66，而吸濕排干率、透氣性、柔軟度等性能更佳，可廣泛應用作纖維(服裝、輪胎、地毯等)和工程塑料(電子產(chǎn)品、汽車部件等)。尼龍54和尼龍510等其它以1,5-戊二胺為單體制成的尼龍產(chǎn)品具有特殊的材料性能，具有潛在的應用價值。

賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺合成途徑中的關鍵酶。賴氨酸脫羧酶存在于各種微生物中。目前，已經(jīng)分別從大腸桿菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、反芻動物月形單胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和鮰愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)等細菌中克隆出賴氨酸脫羧酶基因。

最新的研究普遍采用過表達大腸桿菌的CadA來生產(chǎn)1,5-戊二胺。日本味之素公司的US7189543專利中保護了以二羧酸調(diào)節(jié)pH并通過細胞過表達大腸桿菌的野生型CadA酶轉(zhuǎn)化賴氨酸產(chǎn)生1,5-戊二胺，產(chǎn)量達69g/L。上海凱賽在其專利CN102851307A中通過在蜂房哈夫尼菌中過量表達大腸桿菌野生型CadA酶來轉(zhuǎn)化賴氨酸，從而實現(xiàn)戊二胺和下游聚合物的制備。日本味之素公司的EP3118312專利中公開了熱穩(wěn)定性提高的大腸桿菌CadA突變位點Val3、Ala590和Glu690。日本三井化學公司的US2015132808專利保護了多個活性增加的大腸桿菌CadA突變體，然而，這些CadA突變體的活性提高程度均低于20％，甚至大多數(shù)CadA突變體的活性提高程度不到10％，因此這些CadA突變體在實際生產(chǎn)上的應用價值非常有限。

賴氨酸脫羧酶作為催化賴氨酸生產(chǎn)1,5-戊二胺的催化劑，提升賴氨酸脫羧酶的活性可以減少催化劑的用量或縮短反應時間，進而降低生產(chǎn)成本，對1,5-戊二胺的工業(yè)化有重要的影響，因此本領域急需提升賴氨酸脫羧酶的性能，實現(xiàn)1,5-戊二胺的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種性能提升的賴氨酸脫羧酶，以便實現(xiàn)1,5-戊二胺的工業(yè)化生產(chǎn)。