[發明專利]用于檢測HER2基因的FISH探針、其制備方法及應用

在審

• 申請號: 201710338896.8
• 申請日: 2017-05-15
• 公開（公告）號: CN107245514A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 許寶芝;秦穎;白蛟騰;楊凱麗
• 申請（專利權）人: 德路通（石家莊）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 石家莊旭昌知識產權代理事務所(特殊普通合伙)13126
• 代理人: 彭隨麗

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種用于檢測HER2基因的FISH探針，同時本發明還涉及該FISH探針的制備方法及應用。

背景技術

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率占全身各種惡性腫瘤的7％～10％，僅次于宮頸癌。流行病學調查發現，5％～10％的乳腺癌是家族性的，有明顯的家族遺傳傾向。在40～60歲間、絕經期前后的婦女發病率較高。在我國，婦女乳腺癌發病率正逐年上升，并且顯示出年輕化趨勢。與30年前相比，我國乳腺癌死亡率上升了34.1％，其中城市上升了38.8％，它正以每年3％～4％的速度遞增，死亡率已經排在女性癌癥死亡率之首。乳腺癌病因尚未完全闡明，但許多研究資料表明，乳腺癌的發生除去出生地的因素外，還與內源性或外源性雌激素的長期刺激：雌激素的活性和表皮生長因子受體(HER2)的過表達對乳癌的發生有重要作用。

人類HER-2/neu基因(Her-2基因)定位于染色體17q21，其編碼產物為185kD的跨膜精蛋白p185，由1255個氨基酸組成，720—987位屬于酪氨酸激酶區。HER-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜慵蛋白，是EGFR家族成員之一。HER-2/neu蛋白由胞外的配體結合區、單鏈跨膜區及胞內的蛋白酪氨酸激酶區三部分組成，由于目前尚未發現能與HER-2/neu蛋白直接結合的配體.其主要通過與家族中其他成員包括EGFR(HERl/erbBI)，HER3/erbB3，HER4/erbB4形成異二聚體而與各自的配體結合。HER-2/neu蛋白常為異二聚體首選伴侶，且活性常強于其它異二聚體。當與配體結合后，主要通過引起受體二聚化及胞漿內酪氨酸激酶區的自身磷酸化.激活酪氨酸激酶的活性。HER-2/neu蛋白在胃癌中的表達情況及影響因素HER-2/neu蛋白通常只在胎兒時期表達，成年以后只在極少數組織內低水平表達。然而在多種人類腫瘤中卻過度表達，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發性。腎細胞癌、子宮內膜癌等，并提示預后不良。熒光原位雜交的方法檢測乳腺癌細胞中HER-2/neu基因(17q12)的擴增，作為判斷預后以及乳腺癌藥物治療，尤其是抗HER-2單克隆抗體(赫賽汀)靶向治療的一項輔助檢測手段。

目前檢測HER2基因的方法包括:免疫組織化學(IHC)法檢測HER2蛋白過表達、熒光原位雜交(FISH)法檢測HER2基因拷貝數、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清HER2ECD或腫瘤組織P185。但病理常規工作中最實用的方法是IHC和FISH。IHC較FISH節約成本、簡單易行,但容易受到組織處理方法、固定時間等影響,其結果判斷和解釋存在較大的變異,而FISH具有高度的重復性和可靠性。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測HER2基因的FISH探針的制備方法。

一種用于檢測HER2基因的FISH探針的制備方法包括以下步驟：

a、提取探針合成模板：利用基因組DNA提取試劑盒提取人類基因組DNA，作為HER2基因以及17號染色體著絲粒區域檢測探針合成的模板；

b、第一步PCR反應：采用第一組PCR反應引物，以人體基因組DNA為模板，進行PCR體系的擴增，得到DNA產物；

c、第二步PCR反應：采用第二組PCR反應引物，以與其對應的第一步PCR反應獲得的DNA產物為模板進行PCR體系的擴增，得到第二步PCR反應產物；

d、純化：將第二步PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用PCR產物凝膠回收試劑盒進行切膠、回收、純化，得到檢測HER2基因的FISH探針；

所述的第一組PCR反應引物包括HER2基因第一組PCR反應引物和17號染色體著絲粒區域第一組PCR反應引物；

所述的第二組PCR反應引物包括HER2基因第二組PCR反應引物和17號染色體著絲粒區域第二組PCR反應引物。

相對于現有技術，本發明具有以下有益效果：

利用兩對引物、分別進行兩步PCR獲得探針，如果第一次PCR體系的擴增產生了錯誤片斷，則第二次PCR體系的擴增能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低，因此，增加了擴增特異性。同時通過兩步PCR放大，提高了探針制備效率且降低了生產成本。

進一步的，步驟b第一步PCR反應中包含以下組分：反應引物、模板、2×Es Taq MasterMix。

進一步的，步驟c第二步PCR反應中包含以下組分：反應引物、模板、dNTP、熒光標記的dUTP、Taq DNA聚合酶、含Mg²⁺的10×Taq酶反應緩沖液。